杨 静，李滑滑，洪 玲，沈 娜，曾奎杰，黄 力，倪小英

(1.湖南省粮油产品质量监测中心，湖南 长沙 410201； 2.稻谷及副产物深加工国家工程实验室，湖南 长沙 410201)

近年来，食品安全问题受到国际社会的高度重视，国际食品法典委员会、欧盟、美国和中国均对粮食中包括呕吐毒素在内的几种主要真菌毒素规定了限量标准[1-2]，对粮食检验检测机构检测能力的要求也越来越高。提高检验人员的检测能力与水平，加强实验室质量控制势在必行[3-6]。实验室质量控制活动可分为外部质量控制和内部质量控制，外部质量控制是通过实验室间的比对实验、能力验证和测量审核来进行，而内部质量控制是在相同的实验室环境条件下，通过人员比对、标准物质检测、质控样品分析、校准曲线核查、回收率实验等方法展开[7-8,10-11]。

本研究建立免疫亲和层析净化-高效液相色谱法，通过16名检测人员对小麦中呕吐毒素前处理过程进行人员比对，并采用Z比分数和双试验相对标准偏差对其实验室内部质量控制进行评价。为本实验室的质量控制提供可靠的数据与依据，也可为其他相关实验室的质量控制建设给予参考。

1 材料与方法

1.1 试验计划

按质量控制要求制定比对实验计划，确定比对实验的时间、人员安排、质量监督、检验依据和评价方法。

1.2 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；HY-4A型调速振荡器，常州澳华仪器有限公司；Direct-Q 8UV-R型超纯水机，德国密理博公司；呕吐毒素免疫亲和柱，北京华安麦科生物技术有限公司；呕吐毒素标准物质：100 μg/ml，北京美正检测技术有限公司；甲醇：色谱纯，德国默克公司；全麦粉中呕吐毒素质控样品：800±120 μg/kg和1 845±277 μg/kg，国家粮食和物资储备局科学研究院；全麦粉呕吐毒素空白样品：湖南粮食集团仓库扦取制得；聚乙二醇6000：化学纯，国药集团化学试剂有限公司；玻璃纤维微孔滤纸，上海兴亚净化材料厂生产。

1.3 试样提取

称取25 g试样(精确到0.01 g)，加入5.0 g聚乙二醇，于250 ml锥形瓶中，加入100 ml 水，涡旋混匀，置调速振荡器(200～300 r/min)剧烈振荡20 min，分别通过快速定性滤纸、玻璃纤维微孔滤纸过滤，取上清液备用。

1.4 亲和柱净化

免疫亲和柱平衡后，柱上面连接25 ml一次性注射器，准确移取2.0 ml上清液，调节开关，使液体以1～2滴/s的速度流出；待液体排干后，用去离子水洗涤2次，每次10 ml ；待液体排干后，上样1 ml甲醇，流速1滴/s，收集洗脱液，并在50℃加热条件下氮气吹干，然后准确移取1.0 ml流动相(20%甲醇)复溶，最后用0.22 μm微孔滤器过滤后转移至样品瓶，用于液相分析。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm，5.0 μm)；流动相：80%水+20%甲醇(V/V)；流速：0.8 ml/min；柱温：35℃；进样体积：50 μl；波长：218 nm。

1.6 标准溶液配制

由浓度为100 μg/ml呕吐毒素标准溶液，加入质量分数20%的甲醇溶液定容，依次稀释成浓度为100、250、500、1 000、2 000、5 000 ng/ml的呕吐毒素标准工作液。

1.7 结果统计与评价

比对实验结果须符合GB 5009.111—2016 《食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》(第二法免疫亲和层析净化高效液相色谱法)中相应方法标准规定要求[9]，并以《能力验证结果的统计处理和能力评价指南CNAS—GL02:2018》和《利用实验室间比对进行能力验证的统计方法GB/T 28043—2019》为依据[10-11]，利用Z比分数作为性能统计量评价各参考人员的结果满意度。

式中，xi为测定值，xpt为指定值，σpt为能力评定标准差。

(1)指定值：本次比对考核采用国家有证标准物质，指定值xpt即为标准物质标准值。

(2)能力评定标准差：采用GB/T 28043—2019中8.3的方法，并结合GB 5009.111—2016 中第二法再现性允许差确定。

(3)当指定值的标准不确定度u(xpt)远大于能力验证中能力评定使用的标准差σpt，即u(xpt)>0.3σpt时，指定值的标准不确定度不能忽略，需使用校正的比分数Z'对结果进行评定。

式中，u(xpt)为包含因子k=2时指定值xpt的扩展不确定度。

(4)Z值评价：若∣Z∣≤1，表明“优秀”，1<∣Z∣≤2，表明“满意”，无需采取进一步措施；2<∣Z∣≤3，表明“有问题”，应给予警戒信号；∣Z∣>3，表明“不满意”，需要采取措施。

2 结果与讨论

2.1 线性关系、检出限和定量限

以100 μg/ml 呕吐毒素标准溶液稀释所得的呕吐毒素标准工作液(100～5 000 ng/ml)，在确定的色谱条件下进行测定。以峰面积为纵坐标、质量浓度(单位ng/ml)为横坐标绘制标准曲线。实验结果表明，呕吐毒素含量在100～5 000 ng/ml的范围内线性关系良好，线性方程：If=0.063 5×c-0.076 9，其相关系数R2为1.000 0。在空白全麦粉中添加目标化合物，以3倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)为25 μg/kg；以10倍的倍信噪比确定方法的定量限(LOQ)为83 μg/kg，完全能满足粮食中呕吐毒素的测定需求。

2.2 准确性和重复性

选取不含呕吐毒素的全麦粉样品进行加标和重复性实验，样品中添加了不同浓度的标准溶液(3个浓度水平，添加量相当于呕吐毒素含量500、1 000、2 000 μg/kg)后，放置60 min，使待测成分与样品基体成分相互作用达到平衡，再应用本实验的前处理方法进行操作，其回收率和相对标准偏差结果见表1。

表1 全麦粉中呕吐毒素的加标回收率及相对标准偏差(n=3)

由表1可见，3个浓度水平加标回收率为90.4%～100.1%，3次重复测定的相对标准偏差为0.7%～2.6%，符合一般痕量分析要求。

2.3 人员比对结果统计与评价

为了开展小麦中呕吐毒素人员比对考核项目，通过国家粮食和物资储备局科学研究院购得2个浓度的全麦粉呕吐毒素质控样品作为本次比对样品，将其每个浓度的样品均匀的分装成8份，随机分发给16名参加本次比对的人员。在相同的实验室条件下，16名人员分别单独完成前处理步骤，再由专业人员统一上机测定，其统计结果见表2。

表2 全麦粉中呕吐毒素的检测结果统计表

由表2可见，本次小麦中呕吐毒素人员比对的检测结果双试验相对标准偏差(RSD)均≤9.4%，远低于GB 5009.111—2016 中第二法再现性允许差≤23%；利用Z比分数评价，全部∣Z∣≤1，表明“优秀”。这表明本实验室的检测过程是受控的、可信的、有效的，检测结果是准确的、可靠的。

2.4 实验操作关键点分析

参加本次实验比对的16名人员，均熟悉呕吐毒素检测标准内容，熟练各个样品前处理步骤关键点，有效控制不利的影响因素，在该项检测上具有一致的水平和能力。结合本次人员比对实验和长期从事呕吐毒素项目检测所获经验，认为应当把握以下4个实验操作关键点：①精确称量样品，定量移取提取液、上亲和柱的净化液、氮吹后加入的复溶液，需准确、熟练；②样品加入提取液后，应先小心的手动摇晃，将锥形瓶底未与提取液互溶的固体散开，再置于调速振荡器振荡，确保样品中呕吐毒素的完全提取并释放出来；③亲和柱的操作是整个前处理的最关键步骤，应保证整个操作过程连续、一气呵成，还需要将水洗涤后的亲和柱吹干与处理，避免亲和柱中含水过多，稀释加入的甲醇，影响呕吐毒素的洗脱；④氮吹甲醇往往是最容易操作失误的步骤，氮吹温度、氮气流量不宜太高，以免呕吐毒素伴随甲醇跑掉，过程应连续操作、少接触易吸附的塑料器材，复溶后，涡旋均匀，经微孔滤器过滤后转移至样品瓶。

3 结论

本次开展小麦中呕吐毒素前处理过程人员比对实验，能较好的判定检验人员的检测操作能力与水平，也能加强实验室对检测结果的质量控制及有效监控，提升实验室检测能力水平。本实验通过人员比对的检测结果分析以及实验操作过程的观察，发现影响检测工作准确性的因素有很多，要真正使实验室的检测能力更上一个台阶，在同一实验室人员比对实验的基础上，还须参加上级或外部机构组织的实验室间能力验证活动，才能了解自己在该检测项目中的真实水平，发现问题，采取措施，及时纠正和整改[12]。