刘莉 包名家 王彬 刘丹丹 马永娟 张维娜

佳木斯市疾病预防控制中心 154007

流行性感冒（流感）是由流感病毒引起的具有高度传染性的急性呼吸道传染病。由于流感病毒基因的高度变异性，人群对其普遍易感，易造成人群反复感染、发病率高，可在世界范围内广泛流行。

流感的病原学监测是流感监测的重要内容，病毒分离培养是病原学监测的基础［1］，是流感病毒监测最常用和最可靠的方法之一。佳木斯市疾病预防控制中心流感监测网络实验室通过实时荧光聚合酶链反应（RT-PCR）方法对流感样病例标本进行核酸检测，阳性标本接种MDCK 细胞（Madin-Darby Canine Kidney cells，狗肾细胞）和SPF（specific pathogen free，无特定病原体）鸡胚双腔进行病毒分离。

1 材料与方法

1.1 样本的采集 样本来自佳木斯市两家流感监测哨点医院（佳木斯市中心医院和佳木斯大学附属第一医院）。样本送到实验室后存放至4 ℃冰箱保存，如未及时检测存放于-70 ℃保存待用。核酸检测流感病毒阳性标本最好在24 h 内利用状态良好的MDCK 细胞或SPF 鸡胚进行病毒分离。

1.2 实验材料 SPF 鸡胚和MDCK 细胞由黑龙江省疾病预防控制中心提供，TPCK 胰酶，DMEM 培养基（货号：AE29005267）、胎牛血清（货号：1841924）等细胞培养试剂均为美国GIBCO 公司产品；ABI 7500 型荧光定量PCR 仪为美国AB 公司产品；核酸提取试剂RNeasy Mini Kit（货号：SDKF60101D）为江苏硕世公司产品。流感病毒标准参考血清和参考抗原由国家流感中心配发，人O 型血红细胞来源于本中心工作人员，使用浓度为1%。

1.3 MDCK 细胞接种 核酸检测阳性样本用0.22 μm的过滤器过滤后接种到已经清洗的75%～90%生长良好的成片细胞中，放入5%CO2培养箱中吸附1～2 h，从培养箱中取出细胞培养瓶用PBS缓冲液清洗细胞3次，加入5 ml含终浓度为2 μg/ml TPCK 胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中，置于35 ℃5%CO2培养箱中培养。

1.4 鸡胚接种 按常规鸡胚双腔培养法，取9～11 日龄SPF 鸡胚接种，3 胚蛋/标本，置于35 ℃孵箱孵育72 h 后，置-20 ℃冰箱1～2 h，按常规分别收获尿囊液和羊水。

1.5 分离物鉴定 细胞培养物的收获，当75%～100%细胞出现病变时进行收获，鸡胚收获尿囊液和羊水。培养物收获后采用红细胞凝集试验（HA）和红细胞凝集抑制试验（HI）方法进行病毒型别鉴定。HA 滴度达到8 及以上时，直接进行HI 试验；若HA 滴度小于8 则对培养物进行10-1～10-3稀释后，继续进行病毒传代培养，直到HA 滴度大于等于8。

1.6 统计学处理 数据来源于中国疾病预防控制系统流感监测信息平台，数据信息录入Excel 2007，应用SPSS 23.0 软件进行统计学分析，计数资料用例（百分比）表示，采用卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病毒分离情况 2014.4.1—2020.3.31 流感病毒核酸检测阳性数为811 份。6 个监测年中MDCK 细胞培养法分离流感病毒，每个年份之间分离率差异有统计学意义（χ2=64.640，P＜0.01）；分离率高的年份为2015.4.1—2016.3.31，分离率为60.00%；分离率最低的年份为2019.4.1—2020.3.31，分离率为23.12%。鸡胚双腔培养法分离流感病毒，各年监测中分离率差异有统计意义（χ2=18.429，P＜0.01），2014.4.1—2015.3.31 分离率为0%，2019.4.1—2020.3.31分离率最高，为33.87%。MDCK细胞培养法分离流感病毒总分离率为40.69%，鸡胚双腔培养法总分离率为21.30%，两种培养流感病毒的方法分离率之间差异有统计学意义（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 细胞培养法分离率优于鸡胚双腔培养法。见表1。

表1 MDCK细胞培养法和鸡胚双腔培养法分离流感病毒情况

2.2 亚型分布情况 MDCK 细胞培养法分离流感毒株330 株，其中甲型H1N1 108 株、甲型H3N2 122 株、乙型BV 57 株、乙型BY 43 株；鸡胚双腔培养法分离流感毒株95 株，其中甲型H1N1 59 株、甲型H3N2 0 株、乙型BV 19 株、乙型BY 17株。见表2。

表2 MDCK细胞培养法和鸡胚双腔培养法分离流感毒株亚型情况（株）

2.3 血凝效价情况 鸡胚双腔培养法分离出流感毒株95 株，对应样本MDCK 细胞培养法全部分离出流感病毒，并且病毒血凝效价滴度16 共9 株，≥32 共86 株。见表3。

表3 鸡胚双腔培养法毒株对应样本MDCK细胞培养法分离毒株血凝滴度情况

2.4 毒株代数情况 MDCK 细胞培养法分离流感毒株330 株，二次传代培养分离出毒株数最多185 株，四次传代培养分离毒株数最少8 株；鸡胚双腔培养法分离出毒株95 株，二次传代培养分离出毒株最多为70 株，一次传代培养分离出毒株数最少6 株。从表4 可以看出，MDCK 细胞培养法和鸡胚双腔培养法都是二次传代分离毒株数多。

表4 MDCK细胞培养法和鸡胚双腔培养法分离流感病毒毒株代数情况

3 讨 论

病毒分离和鉴定是诊断病毒感染的“金标准”，对监测流行病的新动向、研究新疾病、新病毒以及新病毒与疾病的关系都有重要作用。目前多采用MDCK 细胞培养法和鸡胚双腔培养法进行流感病毒分离。佳木斯市MDCK 细胞培养法分离流感病毒各年份之间分离率差异有统计学意义（χ2=64.640，P＜0.01）。2015.4.1—2016.3.31 分离率 最高为60.00%，流行的型别以乙型BV 为主（55 株），甲型H3N2 为辅（29 株）（表2）。而2019.4.1—2020.3.31 分离率最低，为23.12%，分离率低的原因可能与2019 年末流行新型冠状病毒有关，流感就诊患者量减少，年后居家隔离，流动性减少有关。鸡胚双腔培养法分离率最高的年份为2019.4.1—2020.3.31，为33.87%。推测疫情原因，核酸检测阳性率低，接种样本量减少，但毒株阳性率不低，均为甲型H1N1亚型，甲型H1N1 亚型对鸡胚很敏感，杨式芹等［2］报道甲型H1N1 流感病毒对鸡胚培养的分离率高于其他季节性流感病毒，这也可能是分离率高的原因。MDCK 细胞培养法和鸡胚双腔培养法分离率之间差异有统计学意义（χ2=48.343，P＜0.01），MDCK 细胞培养法分离率优于鸡胚双腔培养法分离率，这与刘建军等［3］报道MDCK 细胞培养法分离流感病毒比鸡胚双腔培养法敏感报道相符。鸡胚双腔培养法分离出毒株的样本对应的MDCK 细胞培养法全部分离出毒株，并且MDCK 细胞培养法滴度多数≥32（表3），推测MDCK细胞培养法血凝滴度≥32的样本接种到鸡胚双腔中，更容易分离出流感病毒，这为以后提高鸡胚双腔法流感病毒分离率提供参考依据。

1998 年以后的甲型H3N2 亚型病毒的分离多采用MDCK 细胞培养法［4］。病毒的相变异导致甲型H3N2 亚型仅对MDCK细胞敏感，使鸡胚双腔法分离甲型H3N2亚型的阳性率极低［5-7］，所以本实验中为了提高流感病毒的分离率，我们用鸡胚双腔法接种样本时，没有选择核酸阳性的甲型H3N2亚型的样本。乙型毒株则对两种宿主系统都敏感，因此必须同时使用鸡胚双腔和MDCK 细胞两种宿主系统分离流感病毒。MDCK 细胞培养法分离流感病毒可以保证病毒抗原性与原始毒株相近，且可以长时间保存。

MDCK细胞培养的是活的病毒株，所以流感病毒标本在采集、运输保存过程中应注意不要被灭活，另外MDCK 细胞的代数和敏感度与流感病毒分离有很大关系［8］。本实验中两种培养法分离流感病毒均在二次传代分离毒株数高，MDCK细胞培养法二次传代毒株构成比为56.06%（185/330），鸡胚双腔培养法二次传代毒株构成比为73.68%（70/95）（表4）。从省级实验室取回20 代左右的MDCK 细胞后，及时培养，冻存低代数的细胞。当MDCK 细胞传代数接近30 代时候，复苏冻存的MDCK细胞，以保障提高细胞对病毒的敏感性。

目前中医药防治的整体观，是预防、控制、治疗流感的崭新思路。通过药物、饮食、调息等多种疗法，辅助正气、补虚泻实、调和阴阳，提高抗病能力［9］，但流感疫苗是目前预防流感最有效的手段。流感疫苗仍然来自鸡胚分离株，我们需要从鸡胚株中筛选代表株为疫苗推荐提供候选毒株，但是近来流行的甲型H3N2 亚型流感病毒很难在鸡胚中扩增，并且在鸡胚中病毒产生的适应性突变能造成毒株抗原性的改变，因而目前推荐合适的甲型H3N2疫苗组分也是世界卫生组织遇到的挑战［7］，SPF 鸡胚双腔法分离病毒，其主要困难在于鸡胚的来源不稳定、个体差异大、供货周期长和运输成本高等问题，且接种方法对实验人员技术要求较高，故多数实验室该法病毒分离率一直较低［10］。为了提高流感病毒分离率，实验室一直在摸索提高病毒分离率的方法，为流感防控提供科学依据。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突。