毛 山， 周 明， 王俊峰， 李 军， 曹 政

(湖北省十堰市太和医院心内科, 湖北 十堰 442000)

冠心病因冠状动脉血管发生粥样硬化病变引起血管腔狭窄或组塞，进而造成心肌缺氧、缺血、坏死导致的心脏病。随着分子生物学和基因学研究进展，冠心病基因机制的研究受到重视，认为冠心病是多基因遗传性疾病，而基因多态性是决定这种遗传性的重要原因[1,2]。近年来发现，氧化酶P22pbox亚基通过调节酶活性进而促进NADPH氧化酶生成自由基，是自由基生成的重要环节，而第242密码子的C-T基因突变，影响血管自由基生成，可能是诱发颈动脉粥样硬化的原因之一[3,4]。基于此，为探究C242T基因多态性在冠心病发病机制中的作用，研究选取本院118例冠心病性患者与同期96例健康者进行对比，观察其基因型及等位基因频率分布情况，探寻其基因表达与冠心病的相关性，进而为临床诊断和治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2019年10月―2020年10月期间本院收治的118例冠心病患者作为观察组，其中男61例，女57例，年龄39～87岁，平均年龄(64.34±5.26)岁。并选取同期的96例体检无冠心病人群作为对照组，其中男56例，女40例，年龄39～87岁，平均年龄(63.27±5.34)岁。纳入标准：①符合全国脑血管病会议修订的诊断标准，经MRI确诊为冠心病者，年龄>18岁；②临床资料完整者；③患者及家属同意并签署知情通知书者。排除标准：①合并严重心、肝、肾或血液疾病者；②合并全身性慢性或免疫性疾病者；③近期出现颅脑损伤、创伤或手术者；④孕妇哺乳期妇女；⑤不配合基因多态性检测研究者。研究获我院伦理研究委员会批准。

1.2方 法

1.2.1C242T基因检测:引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，采用Gene Amp9300定量聚合酶链反应(PCR-PFLP)仪(ABI)进行SNP检测及终点读序。使用常规序列引物(上游5′-TGCTT-GTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′，下游5′-AA-CACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCGT-3′)，引物稀释冷藏处理后待PCR扩增，PCR反应体系50μL，模板DNA 15 μL，引物2μL，2×PCR反应混合物25μL，双蒸水8μL。PCR反应条件为预变性95℃ 3min，变性 95℃ 30s，退火65℃30s，延伸72℃45s，30个循环，末次延伸72℃10min，然后待反应管冷却至4℃。PCR产物15μL，加上缓冲液3μL，放置2%琼脂糖凝胶上进行电泳，时间为30min，凝胶成像后系统观察。再取PCR产物10μL进行酶切，酶切反应体系20μL，于常温下孵育16h，取酶切产物15μL，加入缓冲液3μL，置于2%琼脂糖凝胶上进行电泳，时间为30min，胶成像后系统检测器结果，分析其基因型，确定C242T基因有TT、CT、CC基因型分布。然后对PCR产物采用核苷酸序列测序验证，确定C242T基因T、C两种等位基因分布频率。

1.2.2指标检测:搜集两组研究对象性别、年龄、BMI、血压史、糖尿病史吸烟史，进行甘油三酯(triglyceride，TG)、同型半胱氨酸(homocysteinemia，HCY)、总胆固醇(totalcholesterol，TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein，LDL-C)、超敏C反应蛋白((high sensitivity C reactive protein，Hs-CRP)、脑钠尿肽(Brain natriuretic peptide，BNP)、脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，LP(a)]、白细胞(white blood cell，WBC)等指标水平检测，使用贝克曼库尔特 AU680 全自动生化分析仪完成检测，并进行对比分析。

1.3观察指标:根据PCR扩增反应结果统计两组研究对象C242T基因中TT型、CT型、CT型及T、C两种等位基因频率的分布情况。

2 结 果

2.1一般资料比较:两组一般资料比较，性别、年龄、BMI、吸烟史、LDL-C等资料差异无统计学意义(P>0.05)，而观察组高血压史、糖尿病史发生率高于对照组，且TG、TC、HDL-C、Hs-CRP、BNP、HCY、LP(a)、WBC等指标水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料比较

2.2C242T基因在两组中基因型和等位基因频率分布情况比较:两组基因分布符合哈代-温伯格(Hardy-Weinberg)平衡(F值分别为0.527和0.715，P>0.05)，因此，两组基因型分布频率达到基因遗传平衡标准，可提现人群基因分布情况，样本具有代表性。且观察组C242T基因中TT型、CT型基因频率和T等位基因频率分布均显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 C242T基因基因型和等位基因频率分布情况比较n(%)

2.3冠心病患者不同基因型携带者血脂指标水平比较:TT+CT型基因携带患者HDL-C水平显著低于CC型基因携带患者(P<0.05)，而不同基因型患者间其他血脂指标水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 冠心病患者不同基因型携带者血脂指标水平比较

2.4冠心病危险因素Logistic回归分析:对有统计学差异的相关因素进行Logistic回归分析，结果显示，糖尿病(OR=1.422，95%CI：1.164～1.737)、HDL-C(OR=1.534，95%CI：1.011～2.329)、HCY(OR=1.241，95%CI：1.159～1.329)、携带T型基因(OR=1.265，95%CI：1.151～1.390)是冠心病的独立危险因素(P<0.05)，见表4。

表4 冠心病影响因素的Logistic回归分析

3 讨 论

NADPH氧化酶是一种广泛分布于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞等氧化酶复合体，C242T基因多态性可通过各种细胞间信号传导途径引起氧化还原基因表达，参与血管壁细胞引起的各种病理过程，可促使血管平滑肌细胞增生，影响血管内皮细胞舒缩功能，刺激炎性反应，参与动脉粥样硬化的发生和发展[5]。本次研究结果发现，C242T基因在冠心病发生中具有重要联系，冠心病患者C242T基因中T型携带者比例更高。因此，对冠心病患者进行基因检测，可为临床诊断及基因调节治疗提供重要依据。

研究通过两组研究对象C242T基因型分布频率发现，观察组C242T基因中T基因型和T型等位基因分布频率显著高于对照组，说明C242T基因中TT基因型和T型等位基因携带者与冠心病的发生密切相关。并且发现，T型基因携患者HDL-C水平显著高于C型基因携带者，提示C242T基因中T基因型携带者对冠心病的发生具有一定促进作用，这与国内外的相关研究中基因多态性在冠心病中具有重要意义的报道具有一致性[6]。究其原因，还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化酶p22phox亚基C242T基因中C242T基因多态性可取代氨酸被酪氨酸，改变NADPH氧化酶活性，进而增加活性氧含量，进而改变血管系统中活性氧氧化还原状态，并导致动脉粥样硬化斑块内平滑肌细胞的增殖，促进低密度脂蛋白氧化，进而加速动脉粥样斑块形成[7]。由此可知，C242T基因可通过影响血管中活性氧诱导内皮炎性反应，促进平滑肌细胞增生，进而导致动脉粥样硬化斑块形成。提示我们可通过对冠心病患者和健康者进行基因分型比较，分析等位基因频率或者基因型在两组人群中分布的差异，从而确定基因多态性是否与冠心病的发病机制，进而指导临床诊断及治疗提供指导依据[8]。

另外，对冠心病危险因素Logistic回归分析结果显示，合并糖尿病、HDL-C高于正常水平、HCY高于正常水平、携带T型基因是冠心病的独立危险因素，说明C242T基因多态性参与冠心病的发生，T型基因携带者冠心病患病率较高。究其原因，糖尿病患者因高糖状态，机体处于免疫缺陷状态，易导致脂质在血管壁累积，进而增加血管病变风险，而成为影响动脉粥样硬化的影响因素之一[9]。HDL-C水平过低，抑制LDL-C氧化修饰作用降低，导致脂质进入血管壁内，而在动脉粥样硬化斑块上沉积，促进动脉粥样硬化发展[10]。HCY过高会促进超氧化酶及过氧化物产生，进而损失血管内皮细胞功能，导致血管平滑肌收缩、缺氧，参与动脉粥样硬化进展[11]。C242T基因T多态性可通过增加活性氧含量，氧化修饰脂蛋白，进而参与动脉粥样硬化斑块的形成及进展，这与国外的相关中C242T基因多态性与高血压、脑梗死、颈动脉粥样硬化等疾病有关的报道一致[12]。但是，研究中样本对象较少，加上基因表达的个体差异，且C242T基因只是冠心病研究的一小部分，且遗传机制较为复杂，涉及多个基因。因此，还需扩大样本进行深入研究，进一步探究基因多态性在冠心病发生机制的意义，了解疾病的遗传基础有助于探索新的疾病通路，发展疾病诊断和治疗的新手段，为临床治疗提供新方向。

综上所述，C242T基因T型携带者更易发生冠心病，可通过检测其基因，深入了解其基因型和等位基因频率的分布和表达情况，找到冠心病发生的内在因素，进而为早期诊断和防治提供了指导。