王洋洋 郑怡 刘晶 邢津骁 汤继芹

(1.潍坊医学院康复医学院 潍坊 261053；2.山东中医药大学康复医学院 济南 250355；3.山东中医药大学继续教育学院 济南 250355)

耳聋已成为最常见的一种内耳感觉障碍性疾病，据世界卫生组织(WHO)2019年数据显示，全球范围内近1/3的65岁以上老人及每500个新生儿就有1个患有不同程度的听力损失[1]。耳聋不但会造成严重的沟通障碍，有研究[2]表明，听力丧失可能是阿尔茨海默病认知障碍的危险因素之一。耳聋可分为感音神经性耳聋、传导性耳聋和混合型耳聋，临床最常见的是感音神经性耳聋[3]。感音神经性耳聋主要是由感觉毛细胞大量损伤或者死亡，且无法再生引起的。所以阐述耳蜗毛细胞的发育过程、损伤原因及再生途径，对于临床预防、诊断和治疗感音神经性耳聋均有很大帮助。在毛细胞形成过程中，Notch信号通路起到了调控作用。γ-分泌酶抑制剂、Math1和microRNA等可以影响Notch信号通路间接作用于毛细胞的修复，这为毛细胞原位再生提供了依据，也为根治感音神经性耳聋提供了新的策略和方向。

1 毛细胞

毛细胞和支持细胞是存在于哺乳动物内耳感觉上皮最主要的2种细胞。当声音传入耳中引起基底膜振动，毛细胞将这种机械刺激转化为电信号，通过听神经传导系统传至听觉中枢，产生听觉[4]。但是由于毛细胞易因耳毒性药物的使用、遗传、内耳微循环障碍、病毒感染、噪声暴露及年龄等因素损伤或者死亡，且无法再生，这将导致永久性感音神经性耳聋[5-6]。临床上改善听力的方法主要是药物治疗、使用人工耳蜗等辅助装置或手术[7]，但无法根治耳聋。

2 Notch信号通路

Notch基因首次在翅膀边缘残缺的果蝇体内被发现[8]，引得大量医学领域的学者对其进行深入研究。目前已证明，Notch信号与中枢神经系统疾病、各种恶性肿瘤、骨发育疾病及血液系统性疾病均有巨大关联[9-12]。

Notch信号高度保守，是一条短距离信号通路，广泛存在于自然界的生物中，可参与细胞增殖、分化等多项生命活动，并维持内环境动态平衡[13]。该通路主要由 Notch膜蛋白受体(分为Notch1-4)、Notch配体即DSL蛋白、CSL转录因子、下游效应物等组成[14]。有研究[15]表明，Notch信号通路可调控毛细胞分化，利用Notch信号通路治疗耳聋成为临床诊治听力障碍的一个新导向。再加上当今生物技术的不断发展，分子治疗越来越广泛，进一步促进人们研究应用Notch信号改善听力，根治耳聋[16]。

3 Notch信号传导途径与毛细胞再生

3.1 Notch信号在毛细胞发育、再生中的作用 内耳发育成熟的过程中离不开多条信号转导途径的共同调节，目前比较公认的通路有Notch信号通路、FGF信号通路、Wnt信号通路等[17]。其中，Notch信号在内耳发育前期负责内耳感觉前体细胞的增殖，后期通过旁侧抑制决定毛细胞和支持细胞的命运，Notch信号途径被抑制的细胞分化为毛细胞，其周围细胞分化为支持细胞形成嵌合体[18-19]。

过去几年研究表明，非哺乳动物听力损伤后可将支持细胞转化成新的毛细胞进而恢复听力[20]，但是成熟的哺乳动物中内耳毛细胞一旦受损便不可再生，听觉永久性丧失[21]。现已表明：新生小鼠的支持细胞具有转分化为毛细胞的潜力，可通过阻断Notch信号在毛细胞和支持细胞的传导实现[22-23]。因此，抑制Notch信号促进再生耳蜗毛细胞是治疗感音神经性耳聋的新策略之一[24]。

3.2 Notch信号通路途径的激活 Notch信号途径没有第二信使的参与，不具备信息放大效应。相邻细胞进行信息传导，细胞内Notch受体接受信号后释放胞内域部分(notch intracellular domain ,NICD，Notch的活化形式)，就此Notch信号通路开始激活并发挥作用。

在哺乳动物听觉感受上皮细胞中，Notch1是主要受体，与之结合的主要是DELl、JAG1和JAG2等配体[18]。分化成功的毛细胞表达Math1和配体Delta1和Jagged2，Notch信号依赖于细胞表面的Notch受体与邻近细胞的DSL配体结合而激活，随后跨膜区S3位点的肽键被γ-分泌酶水解，释放NICD，并被转运到细胞核中。CSL家族(CBF1、SuH、Lag1)转录因子与之结合后，变为转录激活因子，与其他激活物共同促进染色体重建，表达E(spl)/Hes等下游靶基因，产生bHLH转录因子如Hes1和Hes5，具有抑制效应。后两者均与对应的分化效应基因的启动子结合，抑制分化基因转录，从而抑制毛细胞生成[17]。

3.3 Notch信号的影响因素与内耳感觉上皮的再生

1)Notch信号通路可被γ-分泌酶抑制剂(DAPT)抑制，促进毛细胞再生。γ-分泌酶在Notch信号传导过程中意义巨大，主要负责水解分割Notch受体，因此γ-分泌酶抑制剂可显著抑制该通道的酶切过程。

之前认为成年哺乳动物的支持细胞已经失去了自发繁殖与转化毛细胞的能力,但是新的研究表明，在抑制Notch信号传导后，支持细胞仍具有转变为毛细胞的潜力[25]。目前，Ni等[26]、Mizutari等[27]在培养的胚胎或者新生儿耳蜗加入γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号，在原位发现了多余的毛细胞，并证明再生毛细胞主要是由支持细胞直接转分化得来。Li等[28]利用电子显微镜和细胞电生理技术检查P0沙土鼠Corti器再生毛细胞的静纤毛、机械传导、基底外膜和电生理特性，结果证明小鼠出生后抑制Notch信号传导可以将支持细胞转化为毛细胞，且新生毛细胞能够转导机械刺激发挥作用。同时该实验用相同的DAPT处理方式分别培养P0沙鼠和P5沙鼠的Corti器模型，检查静纤毛束和Myo7a阳性细胞的数量，发现后者顶端转角2个指标的增加不如P0沙鼠制备的培养物中明显。这也进一步验证了Liu等[29]提出的Notch抑制的年龄依赖性。

2) 抑制Notch信号促进Math1过表达有利于毛细胞再生。Math1是一种螺旋环转录因子(bHLH)，在内耳上皮感觉毛细胞发育和损伤后再生具有关键作用。Math1首先在E12.5期的胚胎耳蜗基底耳蜗转角的前体细胞中被发现，随后E14.5时在耳蜗基底部激增，并逐渐向耳蜗顶部扩展，在E17.5时整个Corti器发育结束[30]。然后Math1的产生逐渐下降，直到出生后第6天几乎降为零，无法检测到[31]。目前认为毛细胞只有在Math1表达时才能够发育，成熟哺乳动物已经不再表达Math1，这可能会造成内耳毛细胞损伤后无法再生[32]。Luo等[33]研究证明Math1过度表达可在上皮嵴诱导毛细胞再生。

细胞的Notch信号激活后，下游靶基因Hes1、Hes5表达与Math1基因启动子结合，使Math1无法转录表达，所以该细胞无法向毛细胞方向发展，最终成为支持细胞[34]。因此抑制Notch信号可以通过促进Math1表达的方式，影响毛细胞再生。Luo等[35]在实验中使用新霉素破坏原始耳蜗毛细胞后，添加DAPT和Ad5-GFP-Atoh1感染组合时比没有DAPT处理的耳存在更多的GFP/肌球蛋白7A双免疫反应细胞，证明抑制Notch可以显著增强Math1的活性，并将支持细胞转化为毛细胞，从而大大提高新毛细胞形成的效率，在原位产生更多的毛细胞。

3) microRNA可作为调控Notch信号的新靶点。microRNA是一种非编码的、内源性小分子单链RNA，在转录后可抑制相关基因的表达，调节组织分化、器官形成和新陈代谢等过程[36]。目前认为microRNA可能在内耳发育和功能中起重要作用。有研究[37-38]表明，在感觉上皮分化期间，miR-183主要在毛细胞中表达，而Notch1和Hes1主要在支持细胞中表达。根据内耳发育期间miR-183和Notch1的空间独占表达模式表明miR-183和Notch信号传导之间可能存在潜在关联。另外，陈智斌等[39]利用拓扑学分析等方法筛选出能够显著调控Notch信号途径的microRNA分子，主要以microRNA-384-5p为研究对象进行实验，结果显示microRNA-384-5p在小鼠耳蜗中具有特异性表达，在其转染HeLa细胞后，Notch1的表达水平明显下降。该实验证明，miR-384-5p分子可靶向调控Notch信号通路，可作为毛细胞再生的干预靶点。

4) 表观遗传修饰影响成年毛细胞再生。Samarajeewa等[40]指出，表观遗传修饰是成人毛细胞再生能力受限的潜在原因之一。表观遗传修饰在不改变基因核苷酸序列的基础上，可动态、可逆修改细胞的转录状态。除抑制Notch信号外，利用表观遗传酶如HATs、HDACs和DNMTs可能会提高成体阶段的再生成功率。事实上，一些针对DNMTs和HDACs的小分子抑制剂已被批准使用，可能会用于哺乳动物的听觉系统。

4 结语与展望

Notch信号通路抑制耳蜗毛细胞的分化，利用DAPT可以通过抑制Notch信号和上调Math1的表达两方面来促进成熟哺乳动物的支持细胞转分化为毛细胞。另外，microRNA可作为Notch信号调控的靶基因，进一步改善听力。虽然我们对于Notch信号通路及其影响有了大致的了解，但是仍然需要继续深入研究Notch信号通路的作用机制及应用方式。目前大多数数据是在制作的动物耳蜗模型中得到，离应用于人体还有很长的距离，敲除Notch信号途径中的某基因或者使用影响Notch信号通路的药物来治疗耳聋是否具有副作用都需要进一步探讨。因此，如何利用一些关键点更精确地调控Notch信号以诱导存活率高、功能正常的毛细胞是将来重要的研究方向。此外应进一步将研究内耳毛细胞再生的实验建立在动物活体模型基础上，确立靶向调控Notch信号的关键点在修复内耳毛细胞的同时是否还具有其他副作用，以期早日根治感音神经性耳聋。