李云,谢俊霞,宋宁

(青岛大学医学部基础医学院生理学与病理生理学系,山东 青岛 266071)

帕金森病(PD)是第二大常见的神经退行性疾病，随着老龄化程度的逐渐加重，到2030年，中国PD病人将增加至495万，约占全球PD病人的一半[1]。PD最典型的病理学特征是黑质致密部多巴胺能神经元选择性丢失以及路易小体的形成，其中路易小体最主要的成分是异常聚集的α-突触核蛋白，并同时存在着铁的沉积[2]。近年来，α-突触核蛋白被证实可在神经元与邻近的细胞之间传播[3-4]。Rab蛋白是一类小分子三磷酸鸟苷(GTP)结合蛋白，可调控内吞途径中囊泡的形成、转运、黏附和融合等过程[5]。已有研究表明，作为Rab蛋白家族成员，Rab35蛋白磷酸化可促进α-突触核蛋白的传播[6]。细胞内铁沉积不仅能通过芬顿反应引起氧化应激，最近研究还发现了一种新的、铁依赖性的、以脂质过氧化物堆积为主要特征的非凋亡性细胞死亡形式——铁死亡[7-9]。铁死亡在包括PD在内的神经退变疾病中起着极其重要的作用。有研究发现，在小鼠中铁死亡抑制剂ferrostatin-1可降低1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)对多巴胺能神经元的毒性[10]。铁沉积与α-突触核蛋白聚集均是PD发病的重要神经病理学表现，两者之间互相促进，共同参与了PD中多巴胺能神经元退变过程[11]。然而，目前关于铁对α-突触核蛋白细胞间传播的影响仍研究较少，Rab35蛋白作为调控α-突触核蛋白传播的重要分子，铁对其表达的影响和机制尚未见报道。因此，本研究应用多西环素(DOX)诱导建立高表达α-突触核蛋白的PC12细胞模型模拟PD疾病状态，观察枸橼酸铁铵(FAC)对Rab35蛋白表达的影响，并应用铁死亡诱导剂erastin和铁死亡抑制剂ferrostatin-1观察铁死亡在铁调控Rab35蛋白中的作用。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验所用的PC12细胞购自中国科学院上海细胞库；DMEM高糖培养液、胎牛血清(FBS)购自以色列 Biological Industries(BI)公司；FAC、铁死亡诱导剂erastin、铁死亡抑制剂ferrostatin-1购自美国Sigma公司；β-actin抗体购自北京博奥森公司；Rab35抗体购自美国Proteintech公司；HRP-IgG标记的二抗购自英国abcam公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、ECL发光液购自美国Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 PC12细胞的培养

实验前将实验器具高压灭菌。从-80 ℃冰箱中取出冻存的携带α-突触核蛋白过表达载体的PC12细胞，迅速转移至37 ℃水浴锅中，不断摇晃直至完全溶解，将细胞悬液转移到装有10 mL完全培养液的15 mL离心管中，使用吸管充分混匀后，以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入6 mL完全培养液吹打混匀，接种至25 cm2的细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养。每4～5 d传代1次，传代3次时，以2×107/L的密度接种于6孔板中，每孔加入2 mL细胞混悬液培养。当细胞达到60%～70%融合时，加入DOX(2 mg/L)处理24 h诱导α-突触核蛋白过表达。

1.3 实验分组及处理

为观察不同浓度的FAC对Rab35蛋白表达的影响，将过表达α-突触核蛋白的PC12细胞随机分为对照组、FAC低浓度组和FAC高浓度组，分别用基础培养液、100 μmol/L FAC和1 mmol/L FAC处理24 h。为观察铁死亡对Rab35蛋白表达的影响，将细胞随机分为对照组、FAC组、FAC+erastin组和FAC+ferrostatin-1组，对照组和FAC组分别用基础培养液、100 μmol/L FAC处理24 h，FAC+erastin组和FAC+ferrostatin-1组细胞先分别用10 μmol/L erastin和ferrostatin-1预处理30 min后，再加入100 μmol/L FAC共处理24 h。

1.4 免疫印迹法检测Rab35蛋白表达

药物处理24 h后提取蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，按每孔总蛋白20 μg计算上样量，加入Loading Buffer，95 ℃煮5 min。经120 g/L的SDS-PAGE凝胶电泳后湿转到0.22 μm 的PVDF膜上，用50 g/L的脱脂奶粉溶液室温摇床孵育2 h，加Rab35(1∶1 000)和β-actin(1∶10 000)一抗4 ℃摇床孵育过夜。第2天加山羊抗兔HRP-IgG(1∶10 000)二抗室温孵育1 h，然后用TBST溶液洗3次，每次10 min。ECL发光液显影后应用Image J软件进行条带灰度分析，结果以Rab35 与β-actin条带灰度值的比值来表示。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 不同浓度FAC对Rab35蛋白表达的影响

对照组、FAC低浓度组和FAC高浓度组的Rab35蛋白表达水平分别为0.838±0.100、0.936±0.121和0.978±0.154(n=6)。与对照组相比，100 μmol/L 和1 mmol/L FAC单独处理PC12细胞24 h对Rab35蛋白的表达没有明显影响(F=1.601，q=1.726、2.466，P>0.05)。

2.2 铁死亡对Rab35蛋白表达的影响

对照组、FAC组、FAC+erastin组和FAC+ferrostatin-1组Rab35蛋白表达水平分别为0.966±0.137、0.947±0.097、0.818±0.047和0.621±0.086(n=6)。 FAC组Rab35蛋白表达水平与对照组相比没有明显变化(F=13.35，q=0.442，P>0.05)；与对照组、FAC组相比，FAC+erastin共处理对Rab35蛋白的表达没有明显影响(q=3.415、2.973，P>0.05)；但FAC+ferrostatin-1组Rab35蛋白表达水平下调，与对照组、FAC组相比差异具有统计学意义(q=7.933、7.491，P<0.05)。

3 讨 论

PD病因与发病机制仍不清楚，与遗传、环境等因素有关[12-13]。Rab蛋白是Ras超家族成员，一类小分子GTP结合蛋白，是膜转运过程中的关键调节因素[14]，其中一些与PD有关的基因突变，如LRRK2、SNCA、Rab39B与Rab蛋白功能和膜转运有关[15]。Rab35是Rab家族成员，定位于质膜和内体，在内吞循环和肌动蛋白丝重塑中发挥重要作用[16]，被认为是神经突向外生长[17]、细胞因子[18]、吞噬作用[19]、细胞黏附[20]、细胞迁移[21]、细胞极性[22]和外泌体分泌[23]的调节因子。有文献报道，在PD线虫、小鼠模型中，PD相关的激酶LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2)以激酶活性依赖的方式调节α-突触核蛋白的传播，LRRK2G2019S突变可增加LRRK2激酶活性，促进Rab35磷酸化，继而促进α-突触核蛋白的传播[6]。有研究显示，PD小鼠模型(MPTP模型、鱼藤酮小鼠、LRRK2G2019S转基因小鼠)黑质区和PD病人血清中Rab35蛋白表达均升高，且血清Rab35水平与PD发病年龄显著相关[24]。这些结果提示，Rab35可能参与了α-突触核蛋白的加工与转运过程，并且内吞循环可能与PD病理有关。

铁沉积是除了α-突触核蛋白聚集之外PD另一个重要的神经病理学表现。铁可以通过氧化应激导致DNA、蛋白质和脂质过氧化，铁过载还可以导致线粒体功能障碍，使ATP产生减少，继而导致细胞死亡[25]。近年来研究发现，铁死亡参与PD神经退行性病变的过程，但其在PD中的确切机制尚不清楚[10,26]。最近有文献报道，在A53T PD小鼠模型中，铁死亡发生于细胞凋亡之前；在多巴胺能神经元中，铁死亡可促进铁过载导致的细胞凋亡，铁死亡抑制剂可抑制铁过载引起的铁死亡和细胞凋亡，但凋亡抑制剂不能阻止铁死亡的发生[27]。本研究结果表明，在过表达α-突触核蛋白的PC12细胞模型中，FAC处理造成的细胞内高铁对Rab35蛋白的表达没有影响。用FAC和铁死亡诱导剂erastin共同处理时，Rab35蛋白表达水平也没有明显变化。鉴于铁可明显上调细胞内磷酸激酶酪蛋白激酶2(CK2)和Polo样激酶2(PLK2)的表达[28]，同时LRRK2G2019S突变可增强LRRK2激酶活性，促进Rab35磷酸化，继而促进α-突触核蛋白的传播[6]。故我们推测，铁存在及铁死亡发生虽不影响Rab35蛋白表达水平，但有可能影响其磷酸化水平，因此Rab35蛋白翻译后修饰值得进一步研究。用FAC和铁死亡抑制剂ferrostatin-1共同处理时，Rab35蛋白表达水平明显下调。ferrostatin-1是一种小分子铁死亡抑制剂，可特异性抑制RSL(RAS-selective lethal)诱导的细胞死亡，而不能抑制其他氧化性致命化合物和凋亡诱导剂诱导的细胞死亡，ferrostatin-1还被证实能够抑制谷胱甘肽诱导的神经毒性[7]。故我们推测，RSL通路可能参与了Rab35蛋白的表达调控。ferrostatin-1还可以抑制多巴胺能神经元的丢失，改善PD行为及运动障碍[29]。故我们推测，在高铁状态下，由于Rab35本身可促进α-突触核蛋白传播[6]，虽然铁离子本身并不影响Rab35表达，但在铁死亡被抑制的情况下，Rab35的表达下调，故在铁死亡被抑制的情况下可能不利于α-突触核蛋白的传播。

综上所述，在过表达α-突触核蛋白的PC12细胞中，铁不影响Rab35蛋白表达，但铁与铁死亡抑制剂ferrostatin-1共同存在时可降低Rab35蛋白表达，提示铁死亡可能参与了铁对Rab35蛋白的调控。由于Rab35蛋白磷酸化可促进α-突触核蛋白传播，因此Rab35蛋白表达调控异常可能为PD中铁代谢异常和α-突触核蛋白病理学之间的相互关系研究提供了新的理论依据，为PD治疗了提供新的靶点。