关 璐，刘川川，张瑞霞*

(1.青海大学研究生院，青海 西宁 810016；2.青海大学附属医院，青海 西宁 810001；3.青海大学高原医学研究中心，青海 西宁 810001)

目前学者们多关注平原状态下的骨骼肌的糖代谢，对高原脂代谢的研究并不多见且研究结论不一。因此，本研究拟通过对高原低氧低温条件下骨骼肌细胞内脂代谢关键酶HSL和CPT1A及棕色脂肪线粒体内产热基因UCP1的表达水平的研究，观察低氧低温对大鼠骨骼肌细胞脂代谢关键酶及解耦联蛋白1的影响。

1.材料与方法

1.1 材料及动物

胰蛋白酶、DMEM、离心管购于西格玛生物公司；SABC免疫组化染色试剂盒购于博士德生物公司；油红O染色试剂盒购于索莱宝公司。RNA提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购于赛默飞世尔科技公司；cDNA反转录试剂盒、PCR反应试剂盒购于天根生物公司；抗体购于爱博泰克公司。

大鼠购于上海杰思捷实验动物有限公司，体重约140～160g，动物合格证号：20180004012817。

1.2 方法

1.2.1 骨骼肌细胞的分离与培养方法

腹腔注射1.5%戊巴比妥钠(0.2mL/100g)，麻醉后脱颈处死大鼠，浸泡于含75%酒精的容器内，充分消毒后于超净工作台分离骨骼肌。取1 cm3腓肠肌剪碎至1 mm3，用PBS洗涤后离心，去除上清后加2 mL 0.1%Ⅱ型胶原酶消化(37.0℃，20min)，期间吹打混匀，重悬细胞并接种在25 cm2的培养瓶中，细胞约2 h贴壁，镜下观察细胞形态。

1.2.2 骨骼肌细胞的鉴定方法

1.2.3 细胞分组方法

随机分为对照组(nature group，N。氧浓度：21%。37℃)、低氧组(hypoxia group，HO。氧浓度：1%。37℃)、低温组(hypothermia group，HT。氧浓度：21%。28℃)、低氧低温组(hypoxia and hypothermia group，HOHT。氧浓度：1%。28℃)。

1.2.4 RNA分离、逆转录PCR和RT-qPCR方法

用TRIZOL法分离和提取细胞总RNA，在分光光度计上测定总RNA的浓度和纯度，在1%琼脂糖凝胶上进行RNA电泳，通过观察28S RNA及18S RNA以评估RNA的完整性。……