马剑 ，陈智玲 ，张宏志 ，李志强 ，王愈 ，孟超 ，马艳弘 *

（1.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014；2.山西农业大学食品科学与工程学院，山西 太谷 030801；3.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；4.徐州世缘食品有限公司，江苏 徐州 221000）

梨（Pyrus spp），被子植物门双子叶植物纲蔷薇科苹果亚科梨属植物，其汁液丰富、口感香甜，富含氨基酸、维生素、有机酸、矿物质、多酚、膳食纤维等多种营养物质与活性成分［1，2］，具有止渴生津、抗菌消炎、润肠通便等生物活性功能［3］。中国是全球最大的梨果产地，栽培历史悠久，种质资源丰富，其产量位居世界首位，占全球总产量的60%以上，其产业发展前景极其广阔［2］。

梨汁是最主要的梨加工产品，具有良好的天然风味和丰富的营养价值［4］，但由于梨汁存在易褐变［5］、含糖量高、储藏期短等弊端，严重影响相关产品的感官品质、功能特性和市场销售［6，7］。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是指能以碳水化合物为原料产生大量乳酸的革兰氏阳性细菌，其调节肠道菌群、增强免疫力、降低胆固醇等健康功效已经得到医学领域的广泛认可。乳酸菌发酵果蔬汁不仅有利于产品保持更好的色泽、口感、风味和保质期［8~11］，显著降低果汁中的糖含量，有效释放和提高产品中总酚、黄酮、膳食纤维等生物活性物质的含量［12，13］，以及醛类、醇类、酯类等风味有机化合物的含量［13，14］，还能够提高金属离子络合活性、增强抗氧化能力，显著抑制酶促褐变［15，16］。因此，乳酸菌发酵果蔬汁已经成为食品加工领域最受关注的益生菌饮品。

本研究以梨汁为原料，利用乳酸菌复合菌种发酵技术制备功能性梨汁饮品，研究发酵过程中理化指标、营养与功能成分、抑菌及抗氧化活性的变化规律，为提高梨果深加工途径提供技术参数和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜梨果，由徐州世缘食品有限公司提供。

菌种：植物乳杆菌 SD2（CGMCC No.13241）、FM-LP-9（CGMCC No.16701）由本研究室分离鉴定并保存。

果浆酶、果胶酶，购自诺维信生物技术有限公司；DPPH，上海源叶生物科技有限公司；ABTS 自由基，购自南京建成生物工程研究所；苯酚、浓硫酸、3，5-二硝基水杨酸（均为分析纯）等，购自国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯，购于上海化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

D-8 型紫外可见分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司；pH 酸度计，梅特勒-托利多仪器有限公司；JJ500 型电子天平，常熟市双杰测试仪器厂；DK-8D 型电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；TGL-16B 台式离心机；上海安亭科学仪器厂。

1.3 工艺流程

梨→清洗、切分→打浆→酶解→过滤→调节糖度→灭菌→接种→发酵→离心过滤→灌装→杀菌→成品

1.4 操作要点

1.4.1 梨汁制备

梨果清洗干净切块，按1∶1 的质量比加入0.15%的柠檬酸水溶液打浆，用NaOH 溶液将梨汁 pH 调 节 为 5.0~5.5；加入 0.2% 果 胶酶 和0.25%果浆复合酶制剂，45 ℃保温酶解2 h，酶解结束后 90 ℃灭酶活 5 min，冷却，4 500 r·min-1离心15 min，上清液分装于锥形瓶中密封，加热至85 ℃条件下巴氏杀菌30 min，4 ℃冷藏备用。

1.4.2 发酵剂的活化

将−20 ℃冷冻保藏的植物乳杆菌SD-2 和FM-LP-9 甘油管解冻至室温，在无菌条件下按2.5%的接种量分别接种在MRS 液体培养基中，37 ℃活化培养18~24 h，然后将2 种菌发酵液按照2∶1 体积比混合，3 500 r·min-1离心 10 min，弃去上清，沉淀用等体积无菌生理盐水重悬，制得复合发酵剂，备用。

1.4.3 梨汁乳酸菌发酵

按照2.5%的接种量将发酵剂接入制备好的梨汁中，37 ℃静置培养48 h。每隔 6 h 取样，离心分离后取上清测定相应指标。

1.5 理化指标及抗氧化活性测定

1.5.1 理化指标

pH 值采用pH 计测定；总酸含量的测定参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》的方法测定。乳酸菌菌落总数采用平板计数法测定；可溶性固形物含量使用手持糖度仪测定；还原糖的测定采用3，5-二硝基水杨酸法；总酚含量的测定采用福林-酚法，以没食子酸为对照品，根据绘制的标准曲线计算。

1.5.2 体外抗氧化活性的测定

（1） DPPH 自由基清除率的测定

参照马艳弘等［17］的方法，取不同发酵时段的发酵上清液取2 mL 于刻度试管，每管加2×10-4mol·L-1DPPH 溶 液 2 mL，摇 匀 后 避 光 放 置 30 min，取上清液，测定517 nm 波长处的吸光度。实验设空白组、对照组、实验组。DPPH 自由基清除率计算见如下公式：

式中：A1为实验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

（2） 羟基自由基清除能力的测定［18］

取不同发酵时段的发酵上清液取1 mL 于刻度 试 管 中 ，再 加 入 9 mmol·L-1FeSO4溶 液 、8.8 mmol·L-1H2O2溶液各 1 mL，静置 10 min 后加入 9 mmol·L-1水杨酸溶液 1 mL，37 ℃水浴下避光反应30 min，在510 nm 波长处测定吸光度，羟基自由基清除率计算公式如下：

式中：A1为实验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

（3） ABTS 自由基清除能力的测定［19］

取0.2 mL 发酵液加入刻度试管中，加入3.8 mL 工作液（将 0.89 mL 2.6 mmol·L-1的 K2S2O8溶液 与 50 mL 7.4mmol·L-1的 ABTS 自 由 基 溶 液 混匀，4 ℃静置 12~16 h 后使用，使用前用 0.2 mol·L-1pH=7.4 PBS 缓冲溶液稀释 30 倍），在 50 ℃水浴环境中暗反应10 min，于734 nm 测吸光度。ABTS 自由基清除能力公式如下：

式中：A1为实验组吸光度；A2为对照组吸光度；A0为空白组吸光度。

1.6 数据处理

所有试验数据均是3 次重复的平均值并计算标准偏差。采用 SPSS 13.0 软件和 Origin Pro 8.6 软件进行数据分析并作图。

2 结果与分析

2.1 梨汁发酵过程中pH、总酸含量的变化

pH 值和总酸是判断发酵程度的重要指标，其高低反映发酵过程是否正常，还能直接影响产品的口感、风味、品质、以及保质期［5］。由图 1 所示，梨汁发酵过程中，由于梨本身富含的柠檬酸、苹果酸等有机酸的溶出［2］以及乳酸菌代谢产生的乳酸，导致发酵液pH 值不断降低和总酸含量持续增加。发酵24 h 内，随着时间的延长，pH 值快速下降，乳酸不断积累，发酵36 h 时pH 降至3.72，总酸含量升至 3.32 g·100 mL-1，36 h 之后，pH 与总酸变化均趋于平缓。

图1 发酵过程中pH 和总酸的变化Fig.1 Changes in pH value and total acid during fermentation

2.2 梨汁发酵过程中乳酸菌活菌数的变化

乳酸菌是形成发酵制品营养价值和风味特色的决定性因素［20］。检测梨汁发酵过程中乳酸菌数的变化，如图2 所示，在发酵起始阶段（前6 h），由于乳酸菌需要适应新的环境条件，其生长相对缓慢，6 h 之后乳酸菌进入对数生长期，到24 h 时其菌数高达 10.56 log（CFU·mL-1），24 h 之后，由于营养物质的消耗以及发酵液pH 的快速下降，乳酸菌生长受到抑制，最终进入衰亡期。

图2 发酵过程中乳酸菌数的变化Fig.2 Variation of the number of lactic acid bacteria during fermentation

2.3 梨汁发酵中可溶性固形物和还原糖的变化

如图3 所示，随着发酵的进行，可溶性固形物含量快速下降，到24 h 时发酵液可溶性固形物含量为 6.35 °Brix，与发酵前（11.24 °Brix）相比下降了43.51%。24 h 之后，可溶性固形物含量下降速度减缓，到30 h 之后趋于平缓。还原糖在发酵初期略微上升，6 h 之后，还原糖浓度快速下降，到发酵42 h 时还原糖浓度降至3.36%，36 h 时之后还原糖变化趋于平缓。这是由于在发酵初期，乳酸菌在自身酶系作用下将梨汁中的多糖降解，造成发酵液中还原糖含量的小幅上升，之后由于乳酸菌活动增强，乳酸菌利用还原糖进行生长代谢生成乳酸及其他代谢产物，导致还原糖和可溶性固形物持续减少，最终趋于平衡。

图3 发酵过程中可溶性固形物和还原糖的变化Fig.3 Variation of soluble solid and reducing sugar in pear juice during fermentation

2.4 梨汁发酵过程中总酚和中黄酮含量的变化

如图4 所示，黄酮含量在发酵初期（≤6 h）略微下降，发酵6 h 时，梨汁黄酮含量比发酵前下降了8.46%，6~24 h 之内，黄酮含量呈上升趋势，到发酵 24 h 达到最高（164.36 mg·L-1），比发酵前提高了13.08%，发酵24 h 之后黄酮含量下降，逐渐平缓。在30 h 之内，梨汁中总酚含量随发酵时间的延长而增加，发酵30 h 时其含量达138.6 mg·L-1，比发酵前提高了31.13%，30 h 之后总酚含量略微下降，逐渐平缓。可见，适宜条件的乳酸菌发酵不仅能显著降低梨汁糖度，还有利于提高黄酮、总酚等生物活性成分的含量。这可能是由于乳酸菌代谢产生的酶类及其他代谢产物促进了原料中酚类、黄酮物质的释放、溶出和转化导致的。

图4 发酵过程中总酚和黄酮含量的变化Fig.4 Variation of total phenols and total flavonoids in pear juice during fermentation

2.5 梨汁发酵过程中体外抑菌活性的变化

由图5 可见，梨汁发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均有较强的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强。随着发酵时间的延长，梨汁发酵液的抗菌能力逐渐增强，发酵24 h 时达到最大，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌圈分别为16.5、9.78、12.17 mm，分别比发酵前增大了113%、26.03%、68.33%。这可能是由于发酵产生的乳酸、有机酸、细菌素、多酚类化合物协同作用抑制了有害菌的生长。24 h 后其抑菌能力变化不大，基本趋于稳定。

图5 发酵过程中抗菌活力的变化Fig.5 Variation of antibacterial activity in pear juice during fermentation

2.6 梨汁发酵过程中体外抗氧化活性的变化

如图6 所示，梨汁发酵液对DPPH 自由基、ABTS 自由基、羟自由基的都有一定的清除能力，且在发酵过程中3 种自由基清除能力均随着发酵时间延长而增强，发酵液对ABTS 自由基的清除活力最高，对羟自由基的清除活力最低。发酵30 h时，ABTS 自由基、DPPH 自由基、羟自由基的清除能力分别为94.77%、88.76%、65.6%，与发酵前相比，分别提高了92.96%、106.02%、191.52%。发酵30 h 后，梨汁乳酸菌发酵液自由基清除能力趋于稳定。

图6 发酵过程中抗氧化能力的变化Fig.6 Variation of the antioxidant capacity during fermentation

3 讨论

梨果含水量高达80%，其保质期只有5~6 d，是一种高腐性水果，将其加工制备成为梨汁是解决梨果储藏的重要技术手段，其表皮中含有大量多酚化合物，并且是梨果香气的重要来源。梨汁能够保留原果的香气且富含多种酚类化合物，表现出多种有益健康的特征功能。

功能性食品特指医学和食用的特征中间体，具有高价值的健康预防能力，是正常食物的一部分。乳酸菌发酵是制备功能性食品常用技术，使用乳酸菌发酵加工梨汁是一种具有重要经济意义的技术手段。乳酸菌代谢过程中会产生强抗氧化性的代谢产物，增强产品的生物活性功能。通过乳酸菌微生物发酵制备的饮料具有比单一水果饮料更大的抗氧化能力和生物活性。

乳酸菌发酵梨汁是梨汁深加工的新思路，能够提高梨汁产品的生物活性物质，且通过乳酸菌发酵可生产具有市场价值的梨汁副产品市场，对梨果的生产、加工、储藏均有重大意义。乳酸菌在生长过程会消耗大量的糖，发酵0~24 h 时，乳酸菌活菌数迅速上升，处于对数生长期，可溶性固形物含量保持下降，且在代谢过程中产生乳酸等有机酸，同时将梨汁中的结合酚转变为游离酚，使得发酵液总酸、多酚、黄酮指标含量上升，有机酸含量的增加会增强发酵液抑菌活性和抗氧化能力；24 h之后，乳酸菌生长进入静止期，各项指标变化趋势变缓，直至发酵结束。梨汁经过乳酸菌发酵后，糖度迅速降低，可适宜糖年病人食用；有机酸含量和种类的增加，可改善梨汁风味、抑制产品褐变、提升抑菌活性和抗氧化能力，延长储藏期和货架期；食用乳酸菌可以促进肠道健康，乳酸菌可定殖在肠道细胞表面，抑制病原菌生长，保持肠道健康。

4 结论

本研究以梨汁为原料，通过乳酸菌植物乳杆菌SD2、FM-LP-9 复合发酵技术制备发酵梨汁。梨汁发酵过程中pH、可溶性固形物、还原糖含量不断降低，总酸、总黄酮、总酚含量不断升高，发酵液的抑菌活性、抗氧化活性升高。发酵24~30 h 时，pH、总酸、可溶性固形物、还原糖变化逐渐趋于平缓；发酵24 h 时乳酸菌菌落总数、总黄酮达最高，分别为 10.56 log（CFU·mL-1）、164.36 mg·L-1，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌圈比发酵前增大了113%、26.03%、68.33%；发酵30 h 时 总 酚 含 量 达 到 最 高（138.6 mg·L-1），对DPPH 自由基、ABTS 自由基、羟基自由基清除率比发酵前提高了92.96%、106.02%、191.52%。

复合乳酸菌发酵梨汁不仅含糖量低、总黄酮和总酚含量高，还具有较强的抑菌活性和抗氧化活性，是一种极具市场开发前景的益生菌功能饮品，为梨产品深加工拓展思路。