周海银 隆彩霞 罗 兰 陈艳瑛 刘萍萍 肖政辉 张树菊

1.湖南省儿童医院重症医学科，湖南长沙 410007；2.湖南省儿童医院检验科，湖南长沙 410007

脓毒症相关性脑病是一种弥散性脑功能障碍的疾病，曾被称为“感染中毒性脑病”“脓毒症脑病”等[1]。自噬是真核生物中一种进化上高度保守的物质分解代谢途径，参与细胞代谢、蛋白质分泌和细胞介导的免疫反应[2-3]。研究报道，脓毒症相关性脑病大鼠海马区神经细胞存在自噬现象[4]，但这种自噬与脓毒症脑病之间的关系仍不清楚。

石杉碱甲（Huperzine A，HupA）是一种新型石松类生物碱有效单体，具有多靶点作用，除抑制乙酰胆碱酯酶活性外，还能对抗多种因素诱发的氧化应激和细胞凋亡等神经元毒性作用。本研究拟观察HupA 对脓毒症大鼠脑病的保护作用，以及HupA 是否通过核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信号通路调节脓毒症时海马细胞自噬。

1 方法与材料

1.1 仪器与试剂

HupA（美国Sigma 公司）；细胞裂解液和BCA 蛋白含量测定试剂（江苏碧云天公司，批号：P0013B，K11606D）；NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1抗体（美国Abcam 公司，批号：ab320376，ab327450，ab326510，ab326327，ab109390）；荧光倒置显微镜（日本Olympus）。

1.2 动物分组与模型建立

选用健康雄性Wistar 大鼠60 只，体重250～300 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物合格证号为：SYXK（湘）2018-0011。大鼠在温度为22～25℃、相对湿度为55%～60%，12 h/12 h 明暗交替的动物房中饲养。

将Wistar 大鼠按照随机数字表法分成3 组：假手术组、模型组和治疗组，每组20 只。模型组[盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）]。依据参考文献[5]进行CLP 制作脓毒症模型。假手术组大鼠盲肠没有结扎也没有被刺穿，其余步骤与模型组均相同，治疗组术前2 h 大鼠腹腔注射HupA[6]（0.04 mg/kg，1 ml）。本研究中动物处置方法符合动物伦理学3R 标准。

1.3 生理检查

将大鼠麻醉后，在股动脉内放置留置管，连接iWorx 生物信号记录仪提供静脉通道，用于监测术后12 h 各组大鼠平均动脉压（mean arterial pressure，MAP）和心率（heart rate，HR）。

1.4 HE 染色观察海马组织病理改变

建模后第12 小时，取各组大鼠脑组织，于4℃下用4%多聚甲醛固定24 h，行常规苏木精、伊红染色[6]，用倒置光学显微镜拍摄图像。

1.5 免疫荧光染色观察海马组织中LC3 阳性细胞数

切片常规脱蜡至水，柠檬酸盐缓冲液热修复，洗涤切片，滴加10%山羊血清，37℃孵育1 h，同时滴加兔抗LC3 多克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜，洗片后滴加FITC 标记的IgG 荧光二抗，湿孵1 h，观察采用单盲、双人计算每个视野阳性细胞个数[7]。

1.6 Western blot 检测海马区自噬相关蛋白表达

将海马组织置于预冷的RIPA 裂解液中进行裂解，用BCA 法检测蛋白浓度，随后采用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后转至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 溶液封闭1 h，分别加入NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1 一抗（1∶1000 稀释），室温孵育2 h，洗涤，再加入辣根过氧化酶标记的二抗，ECL法显色，采用凝胶成像技术进行分析[8]。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计软件进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组术后12 h 生命体征

术后12 h 模型组MAP 低于假手术组，HR 高于假手术组（P ＜0.05）。治疗组MAP 值高于模型组，HR低于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组术后12 h 生命体征比较（）

表1 各组术后12 h 生命体征比较（）

注：与假手术组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05；MAP：平均动脉压；HR：心率。1 mmHg=0.133 kPa

2.2 HupA 对各组大鼠海马组织病理学影响

假手术组与治疗组海马神经元基本正常，模型组海马细胞紊乱，结构不清楚，神经元出现急性创伤性改变，治疗组病理改变减轻。见图1。

图1 第12 小时各组海马组织病理学改变（HE 染色，100×）

2.3 HupA 对大鼠海马组织中LC3 表达的影响

第12 小时，假手术组、模型组和治疗组每视野LC3平均阳性细胞数分别为：（3.5±0.3）、（16.8±1.5）、（30.4±2.4）个，治疗组LC3 阳性细胞数高于模型组，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图2。

图2 各级组海马组织中 LC3 表达（免疫荧光，400X

2.4 海马组织中NF-κB、LC-3、Beclin1、Rab7 和LAMP-1蛋白表达

第12 小时，模型组Beclin1，LAMP-1 和Rab7 表达水平均低于假手术组，NF-κB、LC3 表达水平高于假手术组，治疗组Beclin1、Rab7 和LAMP-1 表达水平高于模型组（P ＜0.05）。见图3。

图3 石杉碱甲对大鼠CLP 后12 h 海马LC3、Beclin1、LAMP-1和Rab7 蛋白表达的影响（）

3 讨论

脓毒症发生时线粒体损伤、ATP 生成减少、氧自由基增多等均可导致细胞自噬增多[9-10]。课题组依据文献[5]建立大鼠脓毒症模型，生命体征检测发现：模型组MAP 水平逐渐下降，12 h 到达底部，说明12 h时脓毒症发病最严重，因此后续应对术后12 h 进行研究分析。

HupA 是一种高选择性、高效的乙酰胆碱脂酶抑制剂，作为治疗阿尔茨海默病的潜在药物备受关注[11-14]。本研究术前2 h 大鼠腹腔注射HupA，治疗组MAP 水平高于模型组，而HR 下降（P ＜0.05），提示HupA 能减轻大鼠脓毒症相关性脑病，生命体逐渐征恢复；HE染色及免疫荧光观察发现，治疗组病理改变减轻，提示腹腔注射石杉碱甲能促进海马组织细胞自噬，减轻病理性改变。

多种细菌或菌体成分激活巨噬细胞NF-κB 通路是脓毒症形成的中心环节[15-17]。研究发现随着NF-κB表达量上调，自噬泡会随之增加，细胞增殖却相应减少[18]。LC3 被广泛用于监测自噬体的形成或指示自噬体[19]，LC3 分为LC3Ⅰ和LC3Ⅱ，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值可反映自噬水平。除LC3 外，Beclin1、Rab7 和LAMP-1在动态自噬过程中起着关键作用[20-22]。免疫荧光观察发现，与假手术组比较，模型组海马组织中LC3 阳性细胞增多（P ＜0.05），提示脓毒症使大鼠脑内自噬明显增加；Western blot 检测结果，与模型组比较，治疗组大鼠NF-κB 蛋白表达下降，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、LAMP-1、Beclin1 及Rab7 蛋白表达增加。尽管LAMP-1、Beclin1、Rab7 的增加机制尚不清楚，但推测海马组织神经细胞损伤会进一步增加自噬发生[23-25]，诱导自噬相关蛋白表达。此外，免疫荧光检测也显示，与模型组比较，治疗组LC3 阳性细胞数增加（P ＜0.05），这些提示石杉碱甲可能通过抑制NF-κB 表达，上调自噬相关蛋白LAMP-1、Beclin1、Rab7 表达，提高自噬发生，发挥脑神经保护作用。

综上所述，石杉碱甲能抑制NF-κB 表达，促进脓毒症大鼠海马自噬的发生，具有神经保护作用，这为脓毒症脑病提供新的治疗策略。