马子甲，张凯杰，陆胜民，，*，徐志豪，郑美瑜，刘 哲，王 璐，杨 颖

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华321000；2.江苏楷益智能科技有限公司，江苏 无锡 214100；3.浙江省农业科学院 食品科学研究所/浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室，浙江 杭州 310021；4.浙江省农业科学院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310021)

芹菜(ApiumgraveolensL.)别名芹、早芹、香芹、蒲芹、药芹菜、野芫荽，为伞形科芹属中一、二年生草本植物[1]，在我国栽培历史悠久，分布很广，全国大部分地区均有栽培。其含有多种活性物质[2-4]，主要包括类黄酮物质及其苷类化合物(芹菜素、木犀草素)、苯酞类化合物等[5-6]。芹菜具有很好的药用功能[7-8]，其所含的黄酮类物质，包括黄酮及其衍生物多以苷态存在，具有调节毛细血管的脆性和通透性、降血压、降血脂、清除自由基抗氧化、抗凝血和抗血栓形成、抵抗心血管疾病等功效[9-10]。芹菜的根、茎、叶、籽具有降血压的作用，在现代药理学研究中也得到了进一步证实[11-12]。目前，芹菜中降血压活性物质研究较多的是黄酮化合物和多酚类化合物，其中，具有降压作用的黄酮类物质主要为槲皮素、芹菜素和木犀草素[13]，其降压机制可能与减少氧化应激、干扰肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，以及以内皮依赖性和非依赖性方式改善血管内皮功能等有关。芹菜中的多酚类化合物主要有咖啡酸、绿原酸、黄烷醇及其衍生物[14]，多酚类化合物通过提高体内抗氧化酶活性、减少细胞黏附分子表达等机制预防心血管疾病发生[15]。

血管紧张素转换酶(angiotensin coverting enzyme，ACE)活性在调节动脉血压中起关键作用[16]，ACE通过催化血管紧张素Ⅰ转化为有效的血管收缩剂血管紧张素Ⅱ而达到升高血压的作用。黄酮类化合物是一种很好的功能性降压物质，对血管紧张素转换酶具有抑制作用[17]，木犀草素、槲皮素、芦丁、山奈酚和芹菜素在体外有很好的ACE抑制活性[18]。

本文对19个品种芹菜叶水提物的体外ACE抑制活性、总酚和总黄酮含量进行测定，筛选出ACE抑制活性较强和活性成分含量较高的8种芹菜，测定其叶和茎水提物的ACE半抑制浓度(IC50)，以选出体外ACE抑制活性最高或活性成分含量高的芹菜品种，为芹菜的食用和降血压活性成分研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本实验芹菜品种共计19个(表1)，所用的芹菜籽由国家农作物种质资源共享服务平台-蔬菜种质资源子平台、国家蔬菜种质资源中期库提供，并且由浙江省农业科学院蔬菜研究所统一栽培，栽培基地位于桐乡市凤鸣卫杰家庭农场。

1.2 试剂与仪器

血管紧张素转化酶(酶活性为2.0 U·mg-1)，Sigma公司；芦丁(分析纯，97%)、没食子酸(分析纯，98.5%)、卡托普利、马尿酰-组氨酸-亮氨酸(分析纯，98%)，上海源叶生物科技有限公司；福林酚，上海麦克林生化科技有限公司；硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、碳酸钠、硼酸、四硼酸钠、氯化钠均为分析纯。

BS200S-WE1电子天平，余姚金诺电子天平仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；LXJ-HB飞鸽低速大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；SHZ-D(III)型循环水真空泵，杭州明远仪器有限公司；UV-1800紫外/可见分光光度仪，日本岛津公司；DK-8B型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；SCIENTZ-18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 总酚标准曲线制作

采用福林酚比色法[15]，分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mL 100 mg·L-1没食子酸标准溶液于25 mL容量瓶中，加入2.5 mL Folin Ciocalteu显色剂，摇匀；再加入5 mL 5%碳酸钠溶液，加水定容，在40 ℃下避光放置40 min，在750 nm处测定其吸光度。以没食子酸浓度为横坐标，其吸光度为纵坐标，制作总酚标准曲线。

1.3.2 总黄酮标准曲线的制作

采用硝酸铝络合分光光度法[19]，称取无水芦丁标准品适量，加无水乙醇制成200 mg·L-1标准品溶液。吸取该溶液0、1、2、3、4、5、6 mL分别置于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加入10% Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀，静置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，摇匀，加水至刻度，放置15 min后在509 nm的波长处测定其吸光度。以无水芦丁浓度为横坐标，其吸光度为纵坐标，制作总黄酮标准曲线。

1.3.3 芹菜ACE抑制活性的测定

参考Cushman等[20]的方法并进行改进，具体操作步骤为：取5 mmol·L-1的马尿酰-组氨酰-亮氨酸(HHL)溶液200 μL加入4组试管中，分别标记为A、B、C、D；A、B两组加入pH值8.3的硼酸缓冲液30 μL，C、D两组加入等体积的抑制剂(芹菜提取物)，混匀后在37 ℃保温5 min；然后A、C两组加入0.06 U·mL-1ACE溶液100 μL，B、D两组加入等体积pH值8.3的硼酸缓冲液，混匀后在37 ℃反应30 min；反应结束后4组试管均加入250 μL 1 mol·L-1HCl终止反应。然后均加入1 500 μL乙酸乙酯进行萃取，4 000×g离心10 min后取1 mL上层乙酸乙酯萃取液于另一试管，沸水浴15 min蒸发去除乙酸乙酯；再加入3 mL蒸馏水于试管中溶解残留物，在228 nm处测定吸光值。5 mmol·L-1的HHL溶液和0.05 U·mL-1的ACE溶液均由0.1 mol·L-1含有0.3 mol·L-1NaCl的磷酸缓冲液(pH值8.3)配制。ACE抑制活性(I，%)计算公式如下：

(1)

式(1)中：DA，含ACE、不含抑制剂时的吸光度；DB，不含ACE和抑制剂时的吸光度；DC，同时含有ACE和抑制剂时的吸光度；DD，不含ACE但含抑制剂时的吸光度。

1.3.4乙醇浓度对芹菜叶体外ACE抑制活性的影响

在相同提取条件[料液比1∶30(g·mL-1)、提取时间2 h、提取温度60 ℃]下，用不同浓度(0、50%、60%、70%、80%)的乙醇溶液(用蒸馏水配制)提取四季慢芹菜叶冻干粉，4 000×g离心10 min后取上清，用冷冻干燥机冻干提取液后用蒸馏水溶解稀释到2 mg·mL-1，按照1.3.3节的方法，测定其体外ACE抑制活性。

1.3.5 ACE抑制活性与活性成分测定

将冻干的不同品种芹菜叶粉碎，称取0.50 g芹菜叶粉，以蒸馏水为提取剂，在相同条件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取温度60 ℃，提取时间2 h]下提取，4 000×g离心10 min后取上清，按照1.3.4节方法进行体外ACE抑制活性测定，按照1.3.1节方法测定样品总酚含量，按照1.3.2节的检测方法测定样品总黄酮含量。

1.3.6 体外ACE IC50测定

称取初步筛选出来的8种芹菜品种的叶和茎冻干粉各1.00 g，以蒸馏水为提取剂，在相同条件[料液比1∶30(g·mL-1)，提取温度60 ℃，提取时间2 h]下提取，4 000×g离心10 min后取上清液冻干即为芹菜提取物冻干粉。称取上述芹菜提取物冻干粉0.10 g，加蒸馏水稀释成5个浓度梯度，分别为0.781 25、1.562 5、3.125、6.25和12.5 mg·mL-1，测定其体外ACE抑制活性。用Origin 2021软件拟合ACE抑制活性曲线，计算芹菜体外ACE半抑制浓度(IC50)。

1.4 数据处理

每组实验平行进行3次，根据实验结果计算其平均值和标准差，使用统计软件IBM SPSS Statistics 25对实验数据进行差异显著性分析，然后利用IBM SPSS Statistics 25软件对测定的指标进行皮尔逊相关性分析。运用Origin 2021软件对相关系数进行热图绘制，筛选出体外ACE抑制活性最高的芹菜品种。

2 结果与分析

2.1 乙醇浓度对芹菜叶体外ACE抑制活性的影响

由图1可知：在不添加乙醇即提取液为水时，芹菜叶提取物的ACE抑制活性最高，为91.81%；乙醇浓度为80%时，提取物的ACE抑制活性为负，表示其对ACE没有抑制活性，这可能与其冻干粉用水复溶时不完全溶解有关。

柱上无相同小写字母表示试验组间差异显著(P<0.05)。下同。

2.2 体外ACE抑制活性与活性成分含量

由表1可知，19个品种芹菜叶水提物都有体外ACE抑制活性，集中在80%～100%，其中，泾川芹菜叶的体外ACE抑制活性最低，为(79.79±1.02)%，而紫芹叶的体外ACE抑制活性最高，达到了(105.13±1.41)%，这可能是由于芹菜叶提取物中降压活性物质浓度较高造成的。芦丁浓度为0～48 mg·L-1时与吸光度呈良好线性关系，回归方程为y=0.011 1x-0.020 5，R2=0.995 5。根据标准曲线计算得到19个品种芹菜叶水提物的总黄酮含量，总黄酮含量集中在200～250 mg·L-1，中位数为234.7 mg·L-1；其中，白芹叶水提物的总黄酮含量最低，为(168.38±0.88)mg·L-1，白梗芹菜叶水提物的总黄酮含量最高，为(261.71±2.43)mg·L-1。没食子酸浓度为0～8 mg·L-1时与吸光度呈良好线性关系，回归方程为y=0.100 5x+0.016，R2=0.999 5；根据总酚标准曲线计算得到19个品种芹菜叶水提物中总酚含量集中在130～150 mg·L-1，中位数为140 mg·L-1，其中，空杆绿芹叶水提物的总酚含量最低，为(119.40±1.29)mg·L-1，紫芹叶水提物的总酚含量最高，为(182.49±3.65)mg·L-1。

表1 不同品种芹菜叶体外ACE抑制活性及其总黄酮、总酚含量

2.3 体外ACE抑制活性与总酚、总黄酮含量热图分析和相关性分析

从图2可以看出，芹菜叶水提物体外ACE抑制活性较好的品种按活性高低依次为紫芹、细叶芹菜、青梗芹菜、青药芹；总酚含量较高的品种依次为紫芹、四季慢芹菜、细叶芹菜、Ts123.010、青梗芹菜；黄酮含量较高的品种依次为白梗芹菜、青梗芹菜、青药芹、细叶芹菜。体外ACE抑制活性较高的几个品种如细叶芹菜、青梗芹菜等，其总酚或总黄酮含量也较高，说明体外ACE抑制活性与总酚或总黄酮含量有一定相关性。空杆芹菜的总酚和总黄酮含量较低，但其体外ACE抑制活性却较高，说明总黄酮或总酚含量与ACE抑制活性不完全成正相关，体外ACE抑制活性可能是受其他水溶性成分影响。进一步对不同品种芹菜叶体外ACE抑制活性、总黄酮含量和总酚含量进行相关性分析，结果如表2所示，体外ACE抑制活性与总酚、总黄酮含量均呈正相关，相关系数介于0.3～0.6，说明芹菜叶体外ACE抑制活性与其总黄酮、总酚含量有弱相关性。

表2 不同品种芹菜叶的体外ACE抑制活性、总黄酮含量和总酚含量的相关性

在同一行中颜色越深、数字越大表示体外ACE抑制活性或总酚、总黄酮含量越高，图中芹菜品种编号与表1对应。

2.4 不同品种芹菜叶和茎的体外ACE IC50值

以芹菜叶体外ACE抑制活性为主指标，芹菜叶总酚和总黄酮含量为辅助指标，在19种芹菜品种中筛选出较好的8种，分别为四季慢芹菜、紫芹、白药芹、白梗芹菜、青梗芹菜、重庆白芹菜、细叶芹菜、青药芹。考虑到可食用部分茎叶中的活性成分有一定的关联性，为进一步筛选高活性芹菜品种，分别测定叶和茎的体外ACE IC50，其值越小表示ACE抑制活性越高。从图3可看出，各品种芹菜叶的ACE IC50约为茎的1/3，说明芹菜叶对ACE的抑制效果显著(P<0.05)好于芹菜茎。白药芹叶的体外ACE IC50最大，为5.063 mg·mL-1，青梗芹菜叶和四季慢芹菜叶的最小，分别为1.258 mg·mL-1和1.368 mg·mL-1，说明其对血管紧张素转化酶抑制效果最好，其体外降压活性最高；其次为白芹菜(1.829 mg·mL-1)、白梗芹菜(2.298 mg·mL-1)、紫芹(2.591 mg·mL-1)、细叶芹菜(2.642 mg·mL-1)、青药芹(3.835 mg·mL-1)。

柱上无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图中芹菜品种编号与表1对应。

3 结论与讨论

芹菜来源广泛，是人们日常食用的蔬菜之一，但是在平时食用习惯中会丢弃芹菜叶而食用芹菜茎。本实验结果表明，芹菜叶体外ACE IC50约为茎的1/3，说明芹菜叶中降血压物质含量远高于芹菜茎。孙华林等[12]研究表明，在芹菜根、茎、叶3个部位中，芹菜叶对调节大鼠高血压和血脂代谢絮乱的效果最明显，本实验结果与此一致。Che等[21]研究表明，水提可以提高天然产物的生物活性，在提取温度较高时不仅利于水溶性降血压活性物质的提取，还利于部分可溶于热水的黄酮类物质提取，这可能是本研究中芹菜叶水提物比醇提物的体外ACE抑制活性更高的原因。贾丽丽等[22]研究表明，不同芹菜品种之间营养成分含量差异较大，本研究中不同芹菜品种之间体外ACE抑制活性亦有差异，不同品种芹菜其性状也不同，有的品种芹菜叶颜色较深如紫芹，有的品种芹菜叶颜色较浅如白芹。花色苷具有降血压作用[23]，Ojeda等[24]发现，飞燕草色素-3-O-桑布双糖苷和矢车菊素-3-O-桑布双糖苷对血管紧张素转换酶具有竞争性抑制作用。本实验中不同芹菜品种的体外ACE抑制活性不同可能与其所含的花色苷含量不同有关，因为深色叶如紫芹叶通常富含花色苷。

通过对四季慢芹菜、紫芹、白药芹等19个芹菜品种的体外ACE抑制活性及其总黄酮和总酚含量的测定，选出紫芹、青梗芹菜、细叶芹菜、青药芹等8个活性较高的芹菜品种。青梗芹菜叶体外ACE半抑制率最低，其次为四季慢芹菜叶，对ACE抑制效果由高到低为青梗芹菜、四季慢、白芹菜、白梗芹菜、紫芹、细叶芹菜、青药芹和白药芹。本文筛选出的青梗芹菜、紫芹等品种可以作为芹菜降血压活性成分研究与利用的优选品种。

致谢：感谢桐乡市凤鸣卫杰家庭农场时卫杰对本实验芹菜栽培提供的帮助。