于士军，何玲艳，程 铭，徐 鑫，徐馨怡，柴新义，王维坤

(1.滁州学院 生物与食品工程学院，安徽 滁州 239000；2.通用生物系统(安徽)有限公司，安徽 滁州 239000)

蝉花是一种有悠久食用历史的传统中药材，早在公元5世纪的南北朝时期就有关于蝉花使用的记载，并将其外观、功效记入史书[1]。蝉花是由真菌蝉棒束孢侵染蝉幼虫形成的一种虫菌复合体，在蝉花头部白色或者浅黄色分枝称为蝉花孢梗束。野生蝉花产量由于生长环境和季节等因素的影响受到限制，目前已通过研究实现蝉花孢梗束的大规模工厂化人工培养。作为一种传统中药材，蝉花常被用于治疗小儿惊厥、改善视力、保护肾功能、治疗头晕等[2]。现代药理学研究表明，蝉花具有抗肿瘤[3]、抗衰老[4]、抗菌[5-6]、免疫调节[7]等功能。同时，研究证实蝉花含有丰富的营养价值和活性成分，如多糖[4，6]、腺苷[8-9]、麦角甾醇[10]、甘露醇[11]等活性物质。

硒是一种对人体有诸多益处的微量元素，大量研究表明，硒在维持人体自由基水平、增强机体免疫、稳定代谢和调节炎症等方面发挥着重要的作用[12-15]。同时，硒还具有防止克山病、改善糖尿病、改善营养不良、降低癌症发病率等功效[16-19]。但硒在自然界中的分布不均匀，我国是一个缺硒国家，大多数地区都属于缺硒地段[20-23]。自然界中的硒主要以无机硒和有机硒两种形式存在，无机硒一般有毒且不易吸收，有机硒则相反，故人体需要补硒一般是补充有机硒[24-25]。而有机硒通常由无机硒通过生物转化获得[26]。

研究表明，食药用真菌有较强富集和转化硒的能力[27-29]。于田田等[30]在培养蛹虫草菌丝体中添加硒，表明硒可以在蛹虫草中富集并转化为有机硒；而且Hu等[31]研究表明，富硒蛹虫草子实体的水提物和乙醇提取物的DPPH清除能力均显著强于未富硒蛹虫草子实体的水提物和乙醇提取物。王新风等[32]研究表明，富硒培养显著提高了平菇的可溶性蛋白和支链氨基酸含量。

目前，关于富硒蝉花虫草研究报道较少。本研究拟通过在蝉花培养基中添加无机硒，探究蝉花富集和转化硒的能力及硒添加量对蝉花孢梗束中营养和功能成分的影响，为富硒蝉花孢梗束的研究和产品开发提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甘露醇、腺苷，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙腈、甲醇、石油醚、乙酰丙酮、醋酸铵、高碘酸钠，天津市科密欧化学试剂有限公司；盐酸、三氯甲烷，上海振企化学试剂有限公司；磷酸二氢钾，天津博迪化工股份有限公司；鼠李糖，天津市光复精细化工研究所；冰醋酸，江苏强盛功能化学股份公司。

1.2 仪器和设备

Agilent1260高效液相色谱仪，美国Agilent；S-433D氨基酸分析仪，德国赛卡姆公司；Rapid N exceed杜马斯定氮仪，德国Elementar；SOX500脂肪测定仪，中国海能；T6新世纪紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；ANKOM200i半自动纤维分析仪，美国ANKOM Technology等。

1.3 富硒蝉花孢梗束的培养

1.3.1 菌种活化培养

将水液保存的蝉花菌种转接到PDA斜面培养基上，在25 ℃恒温培养箱中培养7 d。

1.3.2 液体菌种的制备

称取马铃薯200 g，切块，加水1 L煮汁。过滤取滤液，加入蔗糖20 g、磷酸二氢钾0.3 g、硫酸镁0.15 g，用水定容至1 000 mL，取200 mL分装于500 mL三角瓶中，在121 ℃灭菌20 min，冷却至室温后接种，置于25 ℃恒温振荡培养箱中2 d。

1.3.3 富硒蝉花固体培养基培养

精确称量磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.15 g、蝉蛹粉50 g、水1 000 mL配制成培养液。分别称取小麦30 g，放入培养瓶中；按照小麦干重的比例依次称量亚硒酸钠添加其中，使亚硒酸钠浓度分别为0、50、75、100 mg·kg-1，每组3瓶，再按照每瓶40 mL向其中倒入培养液，用无菌透气膜封口，包扎，121 ℃灭菌20 min。冷却后接种，然后先避光培养，待培养基表面长满白色菌丝体后取出正常培养，待子实体成熟初产孢便可以采收，采收后的富硒蝉花孢梗束在45 ℃烘箱中烘干，粉碎包装备用。

1.4 营养和功能成分含量测定

蛋白质含量测定使用燃烧法，参考陈秀明等[33]的方法；氨基酸含量参照GB/T 5009.124—2016方法测定；粗脂肪的测定参照GB/T 5009.6—2016第一法索氏提取法测定；多糖含量的测定参照GB/T5009.10—2003进行测定；腺苷含量参照尚红霞等[34]的方法测定；甘露醇含量参考李颜等[35]的方法测定；硒含量采用石墨炉原子吸收分光光度法参考刘文芳等[36]的方法测定。

必需氨基酸指数(EAAI)、生物价(BV)和营养指数(NI)按Schisler等[37]的方法计算。氨基酸比值系数(RCAA)，氨基酸比值系数分(SRCAA)按照FAO/WHO的方法计算[38-39]。

1.5 数据处理

采用Excel 2013和SPSS 19.0 软件进行数据分析，用Duncan新复极差法对组间差异显著性进行分析，以P<0.05为差异具有统计学意义，使用NCSS 2007软件进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 蝉花孢梗束营养和功能成分含量

由表1可知，对照组与富硒实验组及不同富硒实验组之间蝉花孢梗束的硒含量存在显著差异(P<0.05)，且随着硒添加量的增加，富硒蝉花孢梗束中的硒含量呈现显著上升的趋势。对照组蝉花孢梗束中检测到的硒含量仅为0.18 mg·kg-1，当培养基中亚硒酸钠添加量为50、75和100 mg·kg-1时培养的蝉花孢梗束中硒含量分别为83.62、115.61和142.22 mg·kg-1，分别较培养基中的硒含量提高了67.24%、54.15%和42.22%。说明在培养基中添加亚硒酸钠能显著提高蝉花孢梗束中的硒含量，且蝉花孢梗束中硒含量随培养基中亚硒酸钠添加量的增加而增加。表明蝉花孢梗束具有很强的生物富硒能力，通过蝉花固体培养将培养基中的无机硒转化为孢梗束的有机硒[40]。富硒培养提高了蝉花孢梗束中硒的含量，从而提高其药用和保健价值。

由表1可知，富硒实验组蝉花孢梗束中腺苷的含量显著高于对照组腺苷含量(P<0.05)，不同亚硒酸钠添加量实验组之间差异不显著(P>0.05)。与于田田等[30]、Dong等[41]研究富硒培养对蛹虫草中腺苷含量的影响变化一致。50 mg·kg-1富硒实验组与对照组蝉花孢梗束中甘露醇含量差异不显著(P>0.05)，75 mg·kg-1和100 mg·kg-1实验组与对照组差异显著(P<0.05)，且该两组之间差异也显著，表明适量的添加亚硒酸钠能促进蝉花孢梗束中甘露醇的合成。与Dong等[41]研究富硒蛹虫草中甘露醇变化一致。同样50 mg·kg-1富硒实验组与对照组的脂肪含量差异不显著(P>0.05)，其余两组富硒蝉花孢梗束中脂肪的含量显著高于对照组(P<0.05)，且随硒添加量的增加而增加。Dong等[41]和于田田等[30]研究也证实富硒蛹虫草能提供蛹虫草脂肪的含量。

由表1数据也可看出，对照组与50 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束多糖含量差异不显著(P>0.05)，而另两组多糖含量明显低于对照组(P<0.05)，多糖含量随着亚硒酸钠添加量增加而降低，表明高浓度的亚硒酸钠不利于蝉花孢梗束中多糖的生物合成。于田田等[30]研究发现硒能促进蛹虫草菌丝体多糖合成的结果不一致。可能是不同菌种对硒的适应性不同所致，硒具体影响蝉花孢梗束多糖合成的机制还有待于进一步研究。

表1 硒添加量对蝉花孢梗束营养和功能成分的影响

富硒实验组的蛋白质含量显著高于对照组(P<0.05)，100 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质含量最高为35.92%，其次50 mg·kg-1富硒实验组蛋白质含量为34.47%；分别较对照组提高了20.62%和15.75%。100 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质含量高于干口蘑(33.4%)、白蘑(34.7%)的蛋白质含量[42]，表明富硒培养能提高蝉花孢梗束的蛋白质含量。Dong等[41]和于田田等[30]研究表明，富硒培养能提供蛹虫草蛋白质的含量，王新风等[32]研究也证实富硒培养可提高平菇的蛋白质含量。

2.2 蝉花孢梗束氨基酸组成和含量

由表2可知，除色氨酸在样品酸水解过程中被破坏未被检测出外，蝉花孢梗束中检出17种氨基酸。对照组和3个富硒实验组总氨基酸含量分别为21.49%、21.18%、20.29%和21.96%，其中50 mg·kg-1和75 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束的总氨基酸含量略低于对照组，100 mg·kg-1富硒实验组总氨基酸含量略高于对照组。必需氨基酸占总氨基酸的百分比分别为36.35%、38.27%、37.08%和37.76%。

表2 蝉花孢梗束氨基酸组成与含量

对照组和富硒实验组蝉花孢梗束中均是谷氨酸含量最高。谷氨酸含量高的原因可能是因为其处于联合脱氨反应的中心地位，作为其他氨基酸合成直接供体；且其作为中枢神经中含量最高的氨基酸，又参与生物体中许多物质代谢调节；同时，谷氨酸可以与人体体内的血氨结合形成谷氨酰胺，对人体部分组织器官具有解毒功能，比如可消除大脑组织中游离氨基酸的积累，从而增强大脑活跃机能、提高记忆力[43]。其次含量高的是酪氨酸，酪氨酸可以促进黑色素的形成，人体缺乏酪氨酸酶导致酪氨酸合成不足可能出现白化病症状[44]；同时酪氨酸也是一种神经递质前体[45]。富硒蝉花孢梗束与对照组相比蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸等含量均有一定提高，其中蛋氨酸的含量变化明显。这可能是因为硒在生物体中主要以硒蛋白、硒核酸等有机形式存在，而硒代蛋氨酸是硒蛋白的重要组成氨基酸[12，17]。

2.3 对蝉花孢梗束蛋白质营养价值的影响

2.3.1 对蝉花孢梗束蛋白质必需氨基酸组成的影响

根据蝉花孢梗束蛋白质和氨基酸含量计算得到样品必需氨基酸组成如表3，对照组蝉花孢梗束蛋白质的总必需氨基酸含量最高，为343.82 mg·g-1接近FAO/WHO模式的350 mg·g-1；100 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质的总必需氨基酸含量最低，为297.88 mg·g-1。蝉花孢梗束富硒以后其蛋白质的总必需氨基酸含量均有所下降。除了75 mg·kg-1富硒实验组外，对照组和另外两个富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质中蛋氨酸+半胱氨酸的含量均高于鸡蛋模式，且都高于FAO/WHO模式。富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质中苯丙氨酸+酪氨酸的含量分别较对照组降低了18.86%、12.88%和15.20%。对照组和富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质中苯丙氨酸+酪氨酸的含量均高于FAO/WHO模式的60 mg·g-1。异亮氨酸在所有必需氨基酸中含量最低，其中50 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质的异亮氨酸含量最低，仅为21.77 mg·g-1。

表3 蝉花孢梗束蛋白质必需氨基酸组成

2.3.2 对蝉花孢梗束蛋白质的EAAI、BV、NI的影响

由表4可知，对照组的EAAI和BV最高，分别为73.01和67.88；随着在培养过程中亚硒酸钠添加量的增加，富硒实验组的EAAI和BV逐渐变小。实验组EAAI分别比对照组降低了10.52%、11.70%和12.96%，BV较对照组分别降低了12.33%、13.72%和15.19%。据此可判断，如果仅考虑蝉花孢梗束蛋白质的必需氨基酸指数和生物价指标，对照组优于富硒实验组。除75 mg·kg-1富硒实验组外，50 mg·kg-1和100 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束蛋白质NI均高于对照组。

表4 蛋白质的必需氨基酸指数、生物价和营养指数

2.3.3 对蝉花孢梗束蛋白质营养价值的影响

现代营养学研究认为，蛋白质营养价值与食物中必需氨基酸组成密切相关，食物中蛋白质的必需氨基酸组成成分与人体的蛋白质必需氨基酸组成越接近，则表明该食物的蛋白质营养价值越高。必需氨基酸含量过低或过高都会对蛋白质的营养价值产生影响，只有当食物蛋白质中所含氨基酸比例均衡，符合人体所需，才能发挥该食物蛋白质的最高营养价值。根据公式计算得到的RCAA越接近1，与FAO/WHO模式蛋白质氨基酸接近。当RCAA大于1时表明此氨基酸含量相对过剩，当RCAA小于1时表明此氨基酸含量相对不足。SRCAA是氨基酸比值系数分，其是通过计算各种必需氨基酸对总的离散度得出的结果；能更好地评价蛋白质营养价值，其数值越接近100表明蛋白质营养价值越好[39]。由表5可知，当培养基中亚硒酸钠添加量为75 mg·kg-1时蝉花孢梗束蛋白质氨基酸SRCAA为52.60，高于对照组的48.09。表明75 mg·kg-1的亚硒酸钠可提高蝉花孢梗束蛋白质的氨基酸均衡性。

表5 蝉花孢梗束蛋白质的RAA、RCAA、SRCAA

2.4 聚类分析

为综合研究不同亚硒酸钠添加量对蝉花孢梗束营养和功能成分的影响，将所得蝉花孢梗束的营养和功能成分的数据进行标准化处理，以欧氏距离为相似性方法和瓦尔德法为聚类方法软件进行二维聚类分析[46]，结果如图1所示。从图中可看出，75 mg·kg-1和100 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束营养和功能成分组成最为接近，其次是对照组和50 mg·kg-1富硒实验组蝉花孢梗束营养和功能成分组成较为接近。表明亚硒酸钠对蝉花孢梗束的营养和功能成分有明显的影响作用，且随亚硒酸钠浓度的升高，蝉花孢梗束营养和功能成分与对照组差异越大。

图1 蝉花孢梗束营养和活性成分聚类分析

3 结 论

通过营养和功能成分的分析表明，富硒培养的蝉花孢梗束中蛋白质、脂肪、腺苷和甘露醇的含量均较对照组有显著的提高(P<0.05)；仅高富硒组多糖的含量低于对照组(P<0.05)。在蛋白质营养价值方面，富硒蝉花孢梗束蛋白质的必需氨基酸指数(EAAI)和生物价(BV)随着硒添加量的递增呈现不同程度的降低变化，50 mg·kg-1和100 mg·kg-1富硒组蝉花孢梗束营养指数(NI)较对照组略有提高。75 mg·kg-1富硒组蝉花孢梗束的蛋白质氨基酸的均衡性最佳，优于对照组。聚类分析表明，总体上富硒培养时添加亚硒酸钠浓度越高对蝉花孢梗束营养和功能成分影响越大。

营养和功能性成分的变化表明，在培养过程中添加亚硒酸钠可改变蝉花孢梗束的某些代谢途径，对蝉花孢梗束中营养和功能成分合成产生一定的影响，从而使这些含量产生变化[47]。总体上看，75 mg·kg-1富硒组不仅提高了蝉花孢梗束中有益成分的含量，而且提高了蛋白质的营养价值。硒含量的递增说明蝉花能将亚硒酸钠中的无机硒通过蝉花孢梗束在培养生长过程中转化为有机硒，促进有机硒的形成。通过富硒培养将蝉花固有的价值与硒的有益功效相结合，提高了蝉花孢梗束的营养价值和功效作用，可作为一种富硒营养强化剂。但是亚硒酸钠对蝉花菌丝体、孢子的形成、子座的发育等方面的影响还有待于进一步的研究。