吴洪皓，杨 华，吴 鹏

(江西省赣州市中医院，江西 赣州 341000)

肺癌(lung cancer)是常见的恶性肿瘤，并且是五年生存率最低的恶性肿瘤之一。本世纪以来，无论在我国还是全世界，肺癌的年发病人数、年致死人数均已跃居第一[1-2]，其全球年发病人数180万，死亡人数160万[3]，是严重危害人类生命健康的公共卫生问题。肺癌可以分为非小细胞肺癌和小细胞肺癌两大类，其中非小细胞肺癌占肺癌的大多数，而肺腺癌(lung adenocarcinoma)是非小细胞肺癌的三大亚型之一，占总肺癌发病人数的40%以上[4]。尽管早期肺腺癌相对容易治疗，但肺腺癌发病较隐匿，大多数患者就诊时已进展到中晚期，癌细胞已经发生侵袭或转移，导致肺腺癌成为五年生存率较低的恶性肿瘤之一[5]。靶向治疗及免疫治疗的应用在一定程度上改善了这种现状，使患者的生存期得到了延长[6-7]，但耐药以及治疗后的转移仍是亟待解决的一大难题。因此探究合适的治疗药物和治疗靶点对于肺腺癌的研究和治疗意义重大。槲皮素(quercetin)是一种天然黄酮类物质，有研究表明其在肺腺癌中有一定治疗作用[8]；目前microRNAs(miRNAs)在肿瘤中的研究愈加深入，其中已有大量文献报道miR-29b在肿瘤发生进程中参与肿瘤细胞侵袭转移等关键作用机制。而槲皮素介导miR-29b在肺腺癌中的调控机制鲜有报道，因此本研究旨在探究槲皮素通过调节miR-29b介导PI3K/Akt信号通路缓解肺癌A549细胞癌变分子机制。

1 材料

1.1 细胞 人肺癌细胞系A549(批号PT-1034，美国模式培养物保藏中心ATCC)，用基础培养基+20%FBS+8%DMSO培养。

1.2 药物 槲皮素(纯度≥93%，CAS号117-39-5，江苏永健医药科技有限公司)，溶于二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)中，配成20、50、100 μmol/L溶液，在-20 ℃下保存备用。

1.3 仪器与试剂

1.3.1 仪器 酶标仪(美国Bio-Rad公司)；Annexin V-FITC/PI(上海硕嘉生物技术有限公司)；XL型流式细胞仪(美国Beckman Conlter公司)；BPH-9052型细胞培养箱(上海轩仪仪器设备有限公司)；2D双向电泳电泳仪(广州浩翰仪器有限公司)。

1.3.2 试剂 Annexin V-FITC(批号130-092-052)、碘化丙啶PI(批号P8080)、凋亡检测试剂盒(批号CA1020)(上海恒斐生物科技有限公司)；二甲基亚砜(批号D120527)(上海科敏生物科技有限公司)；CCK8(批号CK04)(北京智杰方远科技有限公司)；胎牛血清(批号FBS500-S)、RPMI-1640培养基(批号507767)(美国Gibco公司)；兔抗PI3K(批号ab140307)、兔抗Akt(批号ab8805)、兔抗MMP-2(批号ab37150)、兔抗MMP-9(批号ab73734)、兔抗Bcl-2(批号ab182858)、兔抗Bax(批号ab32503)、兔抗GAPDH(批号ab181602)、IgG抗体(批号ab6721)(英国Abcam公司)。

2 方法

2.1 细胞培养 人肺腺癌A549细胞用含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的伯克改良伊格尔培养基培养，在37 ℃、5%CO2下孵育。

2.2 分组 取处于对数生长期A549细胞，调整细胞密度为1×106/mL，接种到96孔板，每孔200 μL，实验分为4组，每组3个复孔，其中对照组为A549细胞，槲皮素低、中、高浓度组浓度分别为20、50、100 μmol/L。

2.3 指标检测

2.3.1 CCK8法检测细胞增殖 将细胞以2×103个/孔密度接种到96孔板中，设置只加培养基不加细胞的空白对照组用于调零，细胞转染24 h后于24、48、72 h每孔加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃下再孵育4 h，采用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度，计算实验组、对照组吸光度比值，绘制细胞生存能力曲线，重复3次，取平均值。

2.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡 细胞培养后以0.25%胰酶消化各组细胞后，用RPMI-1640培养基终止消化，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，4 ℃预冷的70%乙醇固定，调整细胞密度为1×106/mL，取1 mL细胞，1 500 r/min离心10 min，弃上清，每1 mL细胞加2 mL PBS，离心，弃上清，加入预冷的70%乙醇固定细胞，4 ℃过夜，第2天用PBS洗涤细胞2次，取100 μL细胞悬液，加入50 μg含RNAase的PI染液，避光30 min，100目尼龙网过滤，流式细胞仪记录在488 nm激发波长处红色荧光，检测细胞周期。

2.3.3 Transwell实验检测细胞侵袭水平 细胞培养24 h后，取出-80 ℃保存的基底胶，4 ℃平衡过夜融化成液态，在200 μL无血清培养基中加入200 μL Matrigel胶，稀释基质胶，Transwell板上室加入50 μL，放入培养箱中，孵育2～3 h待胶成为固态后消化细胞、计数，用无血清培养基配成细胞悬液，每孔上室中加入200 μL细胞悬液，下室中加入600 μL含有20% FBS条件培养基，37 ℃培养箱孵育20～24 h。取出Transwell板，PBS漂洗2次，甲醛固定10 min，再用清水洗3次，0.1%结晶紫染色，室温放置30 min，PBS漂洗2次，棉球擦去上表面的细胞，晾干后用倒置显微镜随机计数5个视野的细胞，重复3次，取平均值。

2.3.4 RT-qPCR检测PI3K、AktmRNA、miR-29b表达 采用Trizol提取总RNA，使用逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA，体系20 μL，反应条件为37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，TaqMan MicroRNA Assay和TaqMan® Universal PCR Master Mix用于RT-qPCR，U6 mRNA水平作为内参对结果进行归一化，使用SYBR Premix EX Taq试剂盒进行加样，样品在实时荧光定量PCR仪中进行RT-qPCR反应，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，记录各孔CT值，mRNA以GAPDH为内参，miRNA以U6为内参，采用2-ΔΔCT法计算产物相对表达量。

2.3.5 Western blot检测PI3K、Akt和相关功能蛋白表达 取各细胞提取总蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白浓度，将30 μg总蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，恒定电压80 V，35 min后120 V电泳45 min，转移到PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，倾去封闭液，4 ℃孵育兔抗PI3K、兔抗Akt、兔抗MMP-2、兔抗MMP-9，兔抗Bcl-2、兔抗Bax，兔抗GAPDH，过夜，PBST(含0.1% Tween-20的PBS缓冲液)缓冲液洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的二抗IgG抗体，室温孵育1 h，PBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，于光学发光仪扫描显影后，使用Image Pro Plus 6.0软件分析蛋白相对表达量。

3 结果

3.1 槲皮素抑制A549细胞增殖 与对照组比较，槲皮素组细胞增殖率降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，并与其浓度呈负相关，见表1。

表1 槲皮素对细胞增殖的影响

3.2 槲皮素促进A549细胞凋亡 与对照组比较，槲皮素组细胞G0/G1期细胞增加，S期细胞减少，差异均具有统计学意义(P<0.05)，并与其浓度呈正相关，见表2、图1。

表2 槲皮素对细胞周期的影响

注：A为流式细胞图，B为流式细胞检测直方图。与对照组比较，*P<0.05。图1 各组细胞周期

3.3 槲皮素抑制A549细胞侵袭 与对照组比较，槲皮素组细胞侵袭水平降低，差异均具有统计学意义(P<0.05)，并与其浓度呈负相关，见图2。

图2 各组细胞侵袭(×100)

3.4PI3K、AktmRNA、miR-29b表达 与对照组比较，槲皮素组miR-29b表达升高，并与其浓度呈正相关；PI3K、AktmRNA表达降低，并与其浓度呈负相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

3.5 PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相关功能蛋白表达 与对照组比较，槲皮素组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表达降低，并与其浓度负相关；Bax表达升高，并与其浓度呈正相关，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见图4。

注：与对照组比较，*P<0.05。图3 各组PI3K、Akt mRNA、miR-29b表达

注：与对照组比较，*P<0.05。图4 各组PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及相关功能蛋白表达

4 讨论

槲皮素(quercetin，又名槲皮黄素，C15H10O，相对分子质量302.236)是植物界分布广泛，具有抗肿瘤、抗氧化等多种药理活性的黄酮醇类化合物[9]。在肿瘤研究中已有大量文献报道槲皮素的抗肿瘤作用，Pang等[10]在直肠癌的研究发现，槲皮素可通过靶向SLCO1B1并通过使用该化合物产生增强的作用，抑制细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡来降低直肠癌患者的死亡率，Chen等[11]研究发现，槲皮素能够抑制人皮肤鳞癌癌细胞的上皮-间质转化(EMT)标记和转移能力，进而达到治疗的目的，而在肺腺癌研究领域也有大量关于槲皮素治疗肺腺癌的研究成果，Lee等[12]研究发现，槲皮素在肺癌细胞中可以抑制HSP70表达，并且与肺癌细胞的生长抑制和对化学治疗的敏感性有关，在肺癌治疗中可能具有化学增敏作用。

本次研究中，体外培养肺腺癌A549细胞，用不同浓度(20、50、100 μmol/L)的槲皮素处理，检测结果发现，槲皮素能够降低肺腺癌A549细胞增殖率和侵袭能力，促进肺腺癌A549细胞凋亡。

进一步的研究也发现了槲皮素能够在肺腺癌A549细胞中促进miR-29b表达。目前越来越多的研究发现了miRNA参与生命过程中许多重要进程，包括生长发育、疾病发生，代谢机制，甚至是肿瘤的发生[13]。Sonoki等[14]研究发现，在肺腺癌的研究中，槲皮素可以增加miR-16表达，抑制claudin-2表达从而改善肿瘤进程。Wang等[15]研究也表明，槲皮素可通过调节miR-16-5p和WEE1表达增强非小细胞肺癌细胞的放射敏感性。而关于槲皮素与miR-29b之间的调控关系，目前仅有Wang团队关于糖尿病性视网膜病变的有相关研究[16]。而在肿瘤研究中尚未有相关报道，本研究的发现具有一定的创新性和研究意义。

另外在肺腺癌中槲皮素能够抑制PI3K/Akt信号通路的激活，Huang等[17]在肺腺癌的研究中发现，抑制PI3K/Akt途径能够增强癌细胞对顺铂的耐药性，促进肿瘤细胞的凋亡。有大量研究已经证实了PI3K/Akt信号通路在肿瘤发生过程中扮演的关键角色，探究其在肿瘤发生进程中介导的调控机制是肿瘤研究的重要突破点。

本项目结合中药有效成分，miRNA以及明星信号通路，研究三者之间的靶向调节关系以及在肺腺癌肿瘤调控中发挥的作用，初步探究槲皮素对肺腺癌A549细胞药效作用，在临床应用方面有良好的发展前景和医用价值。但是肿瘤发病机制复杂，本研究得到的结论应用到临床还需要进一步实验验证。