于 丹，底雪梅，张其锵，王 菲，张 海，李 伟*

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.同济大学附属第一妇婴保健院药剂科，上海 201204)

多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome，PCOS)是青春期及育龄期女性最常见的一种内分泌紊乱性疾病，其发生率占育龄妇女的5%～10%，在不孕症患者中发病率可达50%～70%[1-2]。在临床治疗方面，通常采用抗雄激素治疗，二甲双胍、噻唑烷二酮类药物等[3]，但并没有形成规范统一的治疗方案。中医药在治疗PCOS方面有其天然的优势，特别是中药复方可以从整体宏观的角度，通过多成分多靶点多途径协同拮抗起到治疗作用。

当归四逆汤为汉代张仲景所作经典名方，出自《伤寒论》厥阴篇中，是治疗厥阴伤寒的代表方剂[4]。当归四逆汤由当归、桂枝、芍药、细辛、通草、大枣、甘草(炙)等熬制而成[5]。近年来有关当归四逆汤临床研究表明，当归四逆汤可治疗子宫内膜异位症、盆腔炎性等妇科疾病，特别对PCOS疗效确切[6-8]。但有关当归四逆汤的药理作用机制的研究报道较少，其有效成分、作用靶点及分子作用机制还不明确。

网络药理学是系统生物学研究的一部分，其整体观和系统理论与中药复方配伍作用机制完全一致，所以是研究中药复方配伍作用和药理作用机制的有效技术方法，近年来在业内得到广泛应用[9-10]。本研究以当归四逆汤为研究对象，通过构建大鼠PCOS病理模型，评价当归四逆汤的药理作用；然后收集主要活性成分和作用靶点，利用Cytoscape软件构建“成分-靶点”交互作用网络，然后进行GO与KEGG功能富集分析；最后，采用Discovery Studio对主要药效成分和作用靶点进行分子靶点对接，并对当归四逆汤抗PCOS的分子作用机制进行探讨。这将为当归四逆汤进一步的配伍机制研究和临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 当归、桂枝、生白芍、细辛、蜜炙甘草、通草、大枣均购自上海康桥中药饮片有限公司。来曲唑片(批号19991001)，规格2.5 mg/片，购自江苏恒瑞医药股份有限公司。4%多聚甲醛(批号G-1002)购自武汉谷歌生物科技有限公司。石蜡切片机(型号RM2235，德国Leica公司)；光学显微镜(型号IX70，日本Olympus公司)；电子分析天平(型号JA5003N，上海菁华科技仪器有限公司)。SPF级6周龄SD雌性大鼠，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养在同济大学实验动物中心。

1.2 模型建立 50只大鼠每日灌胃给予来曲唑(1 mg/kg)，连续21 d，解剖大鼠可观察到其卵巢表面苍白，包膜增厚明显，体积增大，光镜下可见较多闭锁卵泡，囊泡扩张增加，颗粒细胞层减少，黄体数量下降，说明造模成功。

1.3 分组及给药 称取当归40 g、桂枝30 g、生白芍30 g、细辛10 g、蜜炙甘草20 g、通草20 g、大枣10 g，8倍量85%乙醇超声提取(功率250 W，频率40 kHz)30 min，分离药液，生药量1.0 g生药/mL。大鼠随机分为正常对照组、模型组、当归四逆汤低剂量组(每天6 g/kg)、当归四逆汤高剂量组(每天9 g/kg)、克罗米芬组(每天15 mg/kg)，每组10只，正常对照组、模型组给予等容量生理盐水，均连续15 d。

1.4 卵巢组织病理切片 末次给药后禁食24 h，大鼠颈椎脱臼处死，取新鲜卵巢，4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋常规切片，HE染色，在光学显微镜观下察大鼠卵巢组织病理切片形态学变化。

1.5 当归四逆汤成分和靶点数据库构建 通过中药系统药理学分析平台TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php)，以OB≥30%，DL≥0.18为筛选条件，得到当归四逆汤的活性成分，并检索其药物靶点。通过NCBI PubChem数据库(www.NCBI.nlm.nih.gov/pccompound)查找活性成分的SMILES结构，利用Uniprot(https：//www.uniprot.org/)数据库对检索到的药物靶点进行标准化处理，限定物种为“Homo-Sapiens”，将药物作用靶点名称转换成对应基因名称。以“PCOS”为关键词，在DrugBank(www.drugbank.ca)和Genecards(https：//www.genecards.org/)数据库中检索与PCOS相关的靶点，删除重复靶点，利用Uniprot数据库将其转换成对应基因，最后筛选得到药物与疾病两者的交集作用靶点。

1.6 当归四逆汤成分靶点交互作用和作用机制研究 采用Cytoscape 3.6.1软件，构建当归四逆汤成分-疾病-靶点交互作用网络图。利用“Network Analysis”功能进行网络拓扑属性分析，依据度值大小筛选分析关键化合物。采用DAVID数据库，对交集作用靶点进行GO生物学过程分析和KEGG代谢通路富集分析，预测当归四逆汤作用于PCOS的分子作用机制。采用Discovery studio 3.0分子对接软件建立药物分子与靶点的相关性，首先筛选靶结构均为X射线测定的晶体结构，随后将其导入到Discovery Studio 3.0中，初步预处理后，通过加氢除水和结构简化优化各个结构，同时将化合物SMILES式导入软件构建分子结构，最后将每个分子与靶点结构对接，获得dock参数Xlibdockscore，生成配体-蛋白相互作用三维和二维平面图。

2 结果

2.1 抗PCOS作用评价

2.1.1 大鼠体质量、卵巢质量、子宫质量 表1显示，与正常对照组比较，模型组大鼠体质量、卵巢质量增加(P<0.05)，与大多数临床PCOS患者体质量超重或肥胖、卵巢增大相符；当归四逆汤低、高剂量组大鼠体质量减轻(P<0.05)，表明用药有一定效果。模型组及当归四逆汤低剂量组大鼠子宫质量较低，当归四逆汤高剂量组大鼠子宫质量恢复正常水平(P<0.05)。

表1 各组大鼠体质量、卵巢质量、子宫质量Tab.1 Weights of bodies,ovarians and uterines of rats in each

2.1.2 大鼠卵巢卵泡数及黄体数 与正常对照组比较，模型组大鼠生长卵泡数增加(P<0.05)，成熟卵泡数及黄体数均减少(P<0.05)，提示造模成功；与模型组比较，当归四逆汤低、高剂量组大鼠成熟卵泡数及黄体数升高(P<0.05)，见表2。

表2 各组大鼠生长卵泡、成熟卵泡、黄体数Tab.2 Growing follicles，mature follicles and corpus luteum of rats in each

2.1.3 大鼠卵巢组织形态结构 如图1所示，空白组大鼠卵巢组织形态和细胞结构没有异常，可见不同发育阶段的卵泡、多个黄体，形态完整，排列较为整齐；模型组大鼠卵巢组织可见大小不等的囊腔，粒层细胞被挤压呈扁平或立方形，各种发育阶段卵泡与黄体稀少；与模型组比较，当归四逆汤低剂量组(6 g/kg)、克罗米芬组大鼠卵巢病理性改变减轻。

图1 各组大鼠卵巢组织切片HE染色(×100)Fig.1 HE staining for ovarian tissue sections of rats in each group(×100)

2.2 当归四逆汤成分和靶点数据库构建 在TCMSP数据库中，检索到当归四逆汤化学成分967种，经OB、DL值筛选得到155种，其中当归2种，桂枝7种，白芍13种，细辛8种，通草4种，甘草92种，大枣29种，删除39种无作用靶点的化合物，最终得到116种成分，对应1 791个靶点，重复靶点仅保留1个，共得到282个单一靶点。以“PCOS”为关键词进行检索，在DrugBank和Genecards数据库中搜索相关靶点，删除重复靶点，最终得到疾病靶点2 282个。将282个药物靶点与2 282个疾病靶点进行交集，发现有166个靶点重合。

2.3 核心靶点蛋白互作网络构建 将166个共同作用靶点导入STRING数据库中，绘制相关靶点PPI网络图，见图2，设置置信度为0.9，PPI图中有40个节点，80条边，期望边数为19，PPI的富集显著性P<1.0×10-16。节点代表药物治疗PCOS的作用靶点，边代表靶点与靶点之间有相互作用，说明这些靶点在某些方面是相互关联，协同配合起到治疗疾病的作用。导出含有节点信息的TSV文件，在Cytoscape中分析节点信息，筛选出前14个核心调控基因靶点，结果见表3。

表3 关键靶点基因的拓扑学分析Tab.3 Topological analysis for key target genes

图2 核心靶点蛋白互作网络图Fig.2 Network diagram for Protein-protein interaction of core targets

2.4 “成分-靶点-疾病”网络图构建 116种活性成分用C1-C116表示，40个作用靶点用相应基因代号表示，利用Cytoscape 3.6.1软件构建“成分-靶点”相互作用网络，见图3。该网络图包含157个节点，1 558条边，可直观体现当归四逆汤治疗PCOS的多成分、多靶点的作用特点。再进行网络拓扑属性分析，依据度值大小筛选出排名前10的潜在重要活性成分，见表4。

表4 当归四逆汤主要活性成分Tab.4 Main active ingredients in Danggui Sini Decoction

2.5 生物过程与通路分析 生物过程分析主要涉及一氧化氮生物合成过程的正向调控、RNA聚合酶Ⅱ启动子的转录正调控、药物反应、细胞对有机循环化合物的反应、NF-κB转录因子活性的正调控及凋亡过程的正向调控等，结果见图4A。由此可知，在细胞组成和分子功能方面，主要集中在细胞质溶胶、膜筏和线粒体外膜中，涉及了酶结合、蛋白质同源二聚化结合、类固醇激素受体结合、RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性，配体激活序列特异性DNA结合、蛋白结合等。

通过对40个关键靶点进行KEGG信号通路分析，共得到82条信号通路(P<0.05)，选取其中排名前20者绘制气泡图，进行可视化分析，见图4B。由此可知，共同靶点主要富集于TNF、Toll样受体信号通路、细胞凋亡、甲状腺激素信号通路、神经鞘脂类信号通路、缺氧诱导因子(HIF-1)信号通路等。

注：红色三角形代表当归四逆汤中活性成分，蓝绿色圆角矩形代表蛋白靶点。图3 成分-靶点交互作用网络图Fig.3 Network diagram for Component-Target interaction

图4 生物学过程(A)、KEGG富集分析(B)气泡图Fig.4 Bubble diagrams for biological process(A)and KEGG enrichment analysis(B)

2.6 分子对接结果 将当归四逆汤治疗多囊卵巢综合征的潜在活性成分和PPI分析中的核心靶点分别对接，发现不少化合物能与ESR1、NCOA2、NOS2、CASP8、PPARG、BCL2、IL6对接成功，选取代表性成分异鼠李素(isorhamnetin)、槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、甲氧基菜豆素(1-methoxyphaseollidin)，采用分子对接和二维相互作用图进行分析验证，结果如图5所示。由此可知，异鼠李素中的羟基与PPARG中的PHE360形成氢键，槲皮素中的羟基与BCL2中的VAL133形成氢键，山柰酚中的两个羟基分别与CASP8中的THR337、GLU396形成氢键，甲氧基菜豆素中的一个氧原子与IL6中的GLN175、ARG179形成共轭π键，表明当归四逆汤活性成分预测的作用靶点具有一定的准确性，可以用于后续实验。

图5 “活性成分-作用靶点”分子对接图Fig.5 Diagram for ‘active ingredient s-targets’molecular docking

3 讨论

多囊卵巢综合征是一种以高雄激素血症、排卵障碍、胰岛素抵抗及糖脂代谢异常为基本特征的综合病症，其发病因素复杂，主要包括下丘脑-垂体-卵巢轴调节功能紊乱、机体胰岛素抵抗造成内分泌紊乱等[11-12]。在分子生物学水平，相关信号通路的失衡或者关键基因的异常表达也可以导致PCOS的发生[13]。本研究首先进行了药理学实验验证了当归四逆汤可以有效改善大鼠多囊卵巢综合征，并基于网络药理学的方法，根据当归四逆汤中药材组成建立成分-靶点数据库，经网络图分析，筛选获得潜在活性成分槲皮素、山柰酚、植物甾醇、异鼠李素、甘草黄酮等，其中槲皮素能够改善PCOS胰岛素抵抗，抑制TLR/NF-κB通路，改善PCOS炎症微环境，逆转胰岛素抵抗[14]；山柰酚能够激活AMPK/HO-1信号通路，减轻氧化应激及细胞凋亡，降低炎症反应[15]；异鼠李素具有一定的降血糖活性，还可以抑制血小板聚集，调控一氧化氮合酶活性发挥抗炎作用[16]；其余的活性成分大多为黄酮类化合物，具有抗炎、降低血脂、改善凝血等作用，能发挥抗炎、抗氧化功能。经网络拓扑属性分析筛选出AKT1、ESR1、BCL2、TNF、IL-6等14个关键靶点，推测可能是当归四逆汤活性成分的主要作用靶点。ESR1是一种配体激活的转录因子，该基因编码雌激素受体，在卵泡发育和成熟中发挥至关重要的作用[17]。AR属于核受体超家族成员，是编码雄激素受体的基因，PCOS的病理特征之一就是雄激素水平升高，较高的雄激素水平可以引起 PCOS患者的痤疮、多毛等症状。IL-6基因是趋化因子家族的一种细胞因子，广泛参与炎症反应，IL-6水平升高可以加重PCOS胰岛素抵抗[18]。AKT基因在细胞存活和凋亡中起重要作用，胰岛素等生长和存活因子都可以激活AKT信号途径，研究表明，胰岛素水平缺陷和胰岛素抵抗与PCOS卵巢和子宫内膜中PI3K/AKT/mTOR信号受损有关[19]，这一途径通常与细胞增殖和细胞炎症反应密切相关，AKT基因是其中的关键靶点。综上所述，当归四逆汤可能是通过调控ESR1、AR、IL-6、AKT等关键靶点，介导基因转录调节、炎性微环境、细胞凋亡与胰岛素抵抗等信号途径达到治疗多囊卵巢综合征的作用。

GO和KEGG分析结果涉及一氧化氮生物合成过程的正向调控、对类固醇激素反应、NF-κB转录因子活性的正调控及凋亡过程的正向调控等，涉及信号分子、转录因子、受体、蛋白和酶等多种物质的参与,可能通过调控TNF、Toll样受体、细胞凋亡等信号通路，是一个复杂的生物学过程。类固醇激素包括性激素、肾上腺皮质激素等，其在糖脂代谢、胰岛素抵抗、慢性炎症等多途径发挥调节作用，类固醇激素反应在PCOS的发生发展中扮演重要角色，多途径的参与调节PCOS患者体内微环境[20]。经KEGG分析，TNF信号通路上富集的基因主要有AKT1、IL-6、TNF、CASP8等，TNF、NF-κB信号通路的激活在PCOS的发生发展过程中也起到重要作用。TNF-α是一种与炎症有关的细胞因子，其能够诱导NF-κB结合雄激素受体启动子，激活炎症信号通路，使IL-6、IL-8、IL-1β等炎症因子水平升高，增加卵巢局部雄激素表达，诱导PCOS[21]，有研究显示，当归四逆汤可以降低类风湿性关节炎模型大鼠外周血清TNF-α、IL-6、IL-1β的水平，改善炎症反应[22]；Toll样受体是参与非特异性免疫的一类重要的蛋白质分子，魏慧玲等[23]通过构建硬皮病模型小鼠发现，当归四逆汤可通过下调Toll样受体4(TLR4)以及NF-κB的蛋白表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路，降低炎症因子TNF-α、IL-10 及 IL-16表达。张汝坚等[24]实验证实IL-6在PCOS患者中高表达，其可能是通过胰岛素抵抗或引发慢性炎症在PCOS发病中起作用。本研究通过分析，发现IL-6、TNF等是当归四逆汤治疗PCOS的潜在靶点，结合既往实验研究，进一步推测当归四逆汤可能是通过调控TNF、NF-κB、Toll样受体信号通路中IL-6、TNF等作用靶点来抑制炎症反应、调节脂质代谢和细胞凋亡、改善胰岛素抵抗等多途径来达到治疗PCOS的目的。

综上所述，本研究对当归四逆汤抗PCOS药理作用进行了评价，对其药理作用机制进行了初步研究探索，结果表明，当归四逆汤可以有效改善大鼠多囊卵巢症状，采用网络药理学的方法，对中药复方当归四逆汤治疗PCOS进行了系统分析，说明当归四逆汤是通过多成分、多靶点、多通路协同发挥抗PCOS药理作用的，为当归四逆汤临床应用提供了新思路，也为进一步实验研究奠定了基础，以期可以使更多的多囊卵巢综合征患者受益。