万 静，陈晓兰，杨晓梅，杨敬鸿，韩 伟，高 远

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.福建省南平市人民医院，福建 南平 354200；3.毕节医学高等专科学校，贵州 毕节 551700)

急性乳腺炎是乳腺的急性化脓性感染，好发于产后哺乳的妇女，尤以初产妇更为多见，往往发生在产后3～4周[1]。因乳房血管丰富，早期就可出现寒战、高热及脉搏加快等脓毒血症表现。西医主要通过抗生素等药物治疗和穿刺或引流等手术治疗该疾病，预后较好。但对于哺乳期的妇女使用抗生素，其孩子会出现一些菌群失调、腹泻等症状[2]，而手术治疗会对乳腺外形造成不可修复的损伤。中医以清热解毒、消肿排脓为主[3-4]，临床上用乳腺宁搽剂治疗急性乳腺炎，效果显著。其药物组成有木芙蓉叶和穿心莲。由于搽剂存在施药不方便，药液易于流淌的缺陷，课题组前期将其制备成芙蓉凝胶剂，具有使用方便、贴敷舒适、刺激性小、患者依存性高、载样量大等优势。本研究以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导急性乳腺炎大鼠为对象，通过观察大鼠乳腺组织病理切片，检测其乳腺组织中相关炎症因子白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的水平和髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)的活性,从炎症因子和分子蛋白水平等方面探讨芙蓉凝胶对LPS诱导急性乳腺炎大鼠的保护作用及可能机制，并借助信息熵理论综合评价不同剂量芙蓉凝胶对上述指标的影响，以期为外用新剂型的研发和临床应用提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 SD大鼠，体质量250 g，购于长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号SCXK(湘)2014-0011。给予充足的水和鼠饲料，自由饮水摄食，适应性饲养1周后，雌雄鼠按2∶1的比例同笼饲养，当雌鼠有明显孕相后，将雄鼠移出，待雌鼠自由产仔。

1.2 药物与试剂 空白凝胶膏剂、芙蓉乳腺宁凝胶膏剂(自制，符合凝胶膏剂要求)；乳腺宁贴(批号201804092，桂林市威诺敦医疗器械有限公司)。脂多糖(批号044M4000V，美国Sigma公司)；苏木素(批号180634)及IL-1β、IL-6、TNF-α酶联免疫吸附测定法(ELISA)试剂盒(批号1218E18)均购自南京赛博生物技术有限公司；灭菌PBS溶液(pH 7.2～7.4，批号20180829，北京索莱宝科技有限公司)；MPO兔单克隆抗体[批号ab208670，艾博抗(上海)贸易有限公司]；山羊抗兔工作液(批号SP-9001)、正常山羊血清(批号ZLI-9021)、浓缩型DAB试剂盒(批号K135925C)均购自北京中衫金桥生物技术有限公司。水合氯醛(批号2015050501，成都市新科龙化工试剂厂)；75%乙醇(批号180826，贵州康泰利健消毒制品有限公司)；4%多聚甲醛(批号1804895，兰杰柯科技有限公司)。

1.3 仪器 BCD-201STPA型冰箱(青岛海尔股份有限公司)；Multlskan Mk3型酶标仪[赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司]；-80 ℃冰箱(青岛海尔特种电器有限公司)；徕卡-2016型转轮式切片机(德国Leica公司)；TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；BA400Digital型数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)。

2 方法

2.1 造模 参考文献[5]报道，选取分娩后5～7 d，乳头管明显膨大、完整性好的雌鼠，4%水合氯醛麻醉(0.75 mL/100 g)后固定在手术台上，用剪刀将大鼠第4对乳腺周围的毛小心剔除(不可剪破鼠皮)，面积7 cm2左右，并用医用胶带、铁丝网、纱布固定大鼠腹部，使其松紧适度，不影响饮水摄食，连续4 d。第5天将大鼠麻醉，固定在手术台上，用75%乙醇对第4对乳腺周围消毒，用镊子将该处乳头轻轻调起，使其充分暴露，左手拿小镊子轻轻夹起并固定，右手用剪刀小心剪掉乳头管尖端1 mm左右，用100 μL钝性微量进样器往大鼠每侧乳头管缓慢灌注100 μL 1 mg/mL LPS，停留数秒后，将微量进样器缓慢拔出，用棉签轻揉乳腺周围，使LPS均匀分布。

2.2 药物制备 根据课题组前期均匀试验优选出的最佳基质处方(NP700 0.100 0 g、高岭土0.500 0 g、甘油 4.146 7 g、PVP 0.398 2 g、酒石酸0.004 0 g、甘羟铝0.040 0 g，水4.000 0 g)，加入3%丙二醇促渗剂，制得空白凝胶膏剂[6]。课题组前期以君药木芙蓉叶临床剂量的8倍，即每天1.7 g/kg为有效剂量换算成小鼠总剂量[7-8]，用等比基线法设定木芙蓉、穿心莲不同配比，进行镇痛抗炎实验[9]，确定两者最佳配比为1∶1，分别以空白凝胶膏剂中载10%、1.25%的木芙蓉叶与穿心莲纯化物为高、低剂量组[6]。

2.3 分组与给药 分组前1 h将幼鼠与母鼠分开，将雌鼠随机分为空白组(0 g/kg)、假手术组(0 g/kg)、模型组(0 g/kg)、阳性组(1 g/kg)和芙蓉凝胶低(2 g生药/kg)、高剂量组(16 g生药/kg)，每组10只，空白组、假手术组、模型组均于大鼠第4对乳腺贴空白凝胶，阳性组贴乳腺宁贴，芙蓉凝胶组贴相应的药物，每天1次，连续4 d，第5天模型组、给药组大鼠按“2.1”项下方法处理，空白组不做任何处理，假手术组大鼠缓慢注入灭菌PBS溶液(100 μg/侧)，造模后各组大鼠再给药1次。

2.4 取材 造模24 h后大鼠脱颈处死，固定在手术台上，75%乙醇擦拭第4对乳腺周围，剪刀小心大鼠腹部(切勿剪破腹膜)，剥开皮肤以使乳腺充分暴露，剥离组织，左侧用4%多聚甲醛固定，用于后期制作病理组织学切片和免疫组化切片；右侧迅速转移至-80 ℃冰箱保存，用于IL-1β、IL-6、TNF-α水平的检测。

2.5 病理切片制备和HE染色 流水冲洗固定好的大鼠乳腺组织，梯度乙醇脱水，依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中直至呈透明状态，石蜡包埋，切片，烘干，脱蜡，进行HE染色和封片，在显微镜下观察病理组织变化。

2.6 MPO表达检测 大鼠乳腺组织经脱水、透明、石蜡包埋、切片、烘干、脱蜡后，滴加山羊血清封闭液进行抗原修复并阻断内源性过氧化物酶，加入MPO抗体，在4 ℃湿盒中孵育过夜，加入酶标二抗，室温孵育20 min，DAB显色液显色，终止显色后苏木素复染，脱水后封片，镜检，采用数码三目摄像显微摄像系统对切片进行图像采集，Image-Pro Plus 6.0图像分析系统检测光密度(OD)和面积，计算每张图像平均OD值，用以表述MPO表达。

2.7 TNF-α、IL-1β、IL-6水平检测 将右侧大鼠乳腺组织取出后，按1∶9 的比例加入PBS溶液，组织匀浆机匀浆后离心15 min，弃去上层乳白色脂肪部分，收集上清液，采用ELISA 试剂盒检测组织上清液TNF-α、IL-1β、IL-6水平。

2.8 统计学分析

3 结果

3.1 大鼠乳腺组织病理组织学变化 空白组和假手术组大鼠乳腺小叶结构较为明显，未见其他明显病理变化；模型组大鼠乳腺组织病变严重，乳腺小叶结构较为明显，腺泡数量较为正常，导管管腔内有大量中性粒细胞渗出；阳性组大鼠乳腺小叶结构较为明显，导管及腺泡管腔内有少量中性粒细胞渗出，未见其他明显病理变化；芙蓉凝胶低剂量组乳腺小叶结构较为明显，导管管腔内有较多中性粒细胞渗出；芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺小叶结构明显，导管上皮细胞形态及腺泡数量较为正常，导管管腔内有少量中性粒细胞渗出，见图1。与空白组比较，模型组大鼠炎症反应及乳腺、导管等细胞损伤明显增强；与模型组比较，阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠病变程度相对较轻，芙蓉凝胶低剂量组作用一般，提示阳性组、芙蓉凝胶高剂量组对急性乳腺炎模型大乳腺组织有较好改善作用。

图1 大鼠乳腺组织病理图(HE，×400)Fig.1 Histopathological images for mammary gland of rats in each group (HE，×400)

3.2 大鼠乳腺组织MPO表达 表1显示，模型组大鼠乳腺组织MPO表达升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺组织MPO表达均降低(P<0.01)，芙蓉凝胶低剂量组无明显变化(P>0.05)。

表1 各组大鼠乳腺组织MPO表达Tab.1 MPO expressions in mammary glands of rats in each group

3.3 大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平 与空白组比较，模型组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性组、芙蓉凝胶高剂量组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平均降低(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠乳腺组织IL-1β、IL-6、TNF-α水平Tab.2 Levels of IL-1β,IL-6 and TNF-α in mammary glands of rats in each

3.4 药效评价 对上述指标数据进行标准化处理，结果见表3，以其建立原始药效指标矩阵(X)后转换为概率矩阵(P)，见图2，再根据概率矩阵计算第i个指标的熵值(Hi)，得Hi=[0.700 8,0.954 9,0.949 8,0.955 4]，计算各指标的权重系数(Wi)，为[0.681 4,0.102 7,0.114 3,0.101 6]，阳性组、芙蓉凝胶低剂量组、芙蓉凝胶高剂量组的M值分别为0.565、0.083、0.352，可知芙蓉凝胶高剂量组综合影响较大，低剂量组影响较小。

表3 各组指标数据标准化处理结果Tab.3 Results of standardized processing of indicator data in each group

图2 药效指标矩阵(X)和概率矩阵(P)Fig.2 Pharmacodynamic index matrix (X)and probability matrix (P)

4 讨论

LPS诱导的炎症可使TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高，且TNF-α、IL-1β能够调节嗜中性粒细胞的渗出，造成乳腺组织损伤，而MPO的表达和分布与嗜中性粒细胞的数量成正相关[14-15]，故本实验选用TNF-α、IL-1β和IL-6指标评价芙蓉凝胶对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠的影响。经芙蓉凝胶干预后，大鼠乳腺组织MPO的表达降低，高剂量组IL-1β、IL-6、TNF-α水平受到抑制，即对急性乳腺炎大鼠有较好的保护作用。

熵在信息论中，表示不确定性的量度[16]。熵权法以信息熵理论为依据，客观地对各因素赋权，进行综合评分，可为多指标研究数据分析提供依据[17]。在药物效应评价试验数据处理中，利用信息熵理论对多个效应评价指标进行客观赋权，建立综合评价度量指标，其综合评分能直观清晰反映不同剂量组药物对多个效应指标的综合影响，同时也避免了各指标数据间的相互影响，提升实验研究的科学性与严谨性[18-19]。本研究借助信息熵理论，以炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平及MPO表达为药效评价指标，最终建立综合药效评价度量指标，考察不同剂量芙蓉凝胶对大鼠MPO表达及炎症因子水平的综合影响。通过熵权法公式计算各指标的信息熵值，指标的信息熵越小，该指标提供的信息量越大，权重就越高，在综合评价中所起作用越大[20]。熵权法计算得MPO信息熵最小，说明该因子在综合评价中所起作用最大，在对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠进行药物效应评价时，选择以MPO表达为评价指标具有一定可靠性。经芙蓉凝胶干预后，高剂量组MPO免疫组化检测OD值降低(P<0.01)，即MPO的表达被抑制。熵权法综合评分结果显示，各药效指标的综合评分阳性组最高，芙蓉凝胶高剂量组次之，芙蓉凝胶低剂量最低，表明芙蓉凝胶对LPS诱导的急性乳腺炎模型大鼠有一定改善作用，其机制可能与抑制大鼠乳腺组织MPO表达有关。