郭胜男，张 莉，吴深涛，刘弘毅

(1.山东大学第二医院，山东 济南 250000；2.天津河东盛世众康医院，天津 300171；3.天津中医药大学第一附属医院，天津 300380；4.云南中医药大学第一附属医院，云南 昆明 650000)

据国际糖尿病联盟估计，到2045年，全球糖尿病的患病人数将从2017年的4.25亿增加到6.29亿[1]。2型糖尿病更为普遍，约占糖尿病患者的90%，主要是由胰岛素抵抗和代偿性胰岛素分泌不足引起[2-3]。导致胰岛素抵抗和2型糖尿病的危险因素很多，不可改变的危险因素有家族病史、年龄(>45岁)等；可改变的危险因素有肥胖、高血脂、高血压等。但是，这些传统的常规危险因素不能完全解释全世界范围内2型糖尿病患者人数的迅猛增加，但其与全球城市化和工业化进程相一致[4]。

持续性有机污染物是全球工业化发展带来的环境污染物，是污染物中最具代表性的有毒化学物质[5]，可通过食物链在人体中(例如血液、脂肪、肝脏、母乳等)积累，对人体健康构成巨大威胁[6]。德国哈勒和奥格斯堡两项队列研究证实，持续性有机污染物具有在一般人群中致胰岛素抵抗及糖尿病的影响[7]。

先前的动物研究结果表明，吴深涛教授的经验方——化浊解毒方能够显著改善二恶英及多氯联苯标准品暴露的ZDF大鼠糖毒性、脂毒性及由其引起的胰岛素抵抗[8-9]，但具体分子生物学机制目前尚不明确。本课题选用了1种具有代表性且毒性较强的持续性有机污染物——PCB126，建立ZDF大鼠染毒模型，探究化浊解毒方改善染毒大鼠脂肪组织胰岛素抵抗的分子生物学机制，为未来抗糖尿病药物的研发提供科学依据。

1 材料

1.1 动物及饲料 选用SPF级健康雄性 ZDF(fa/fa)大鼠作为模型对照，体质量180～200 g；选择SPF级雄性ZDF(fa/+)大鼠作为正常对照，体质量140～160 g，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号SCXK(京)2016-0006。PMILabdiet5008饲料配比为粗蛋白24%，粗脂肪7.1%，粗纤维3.2%，无氮浸出物48.9%，矿物质(有机物)6.7%，维生素3.2%，购自雍立(上海)生物科技有限公司。

1.2 药物 多氯联苯126(3,3′,4,4′,5-pentachlorobiphenyl，PCB126)，CAS号57465-28-8，分子式C12H5CI5，购自北京曼哈格生物技术有限公司；CH223191(CAS号301326-22-7，分子式C19H19N5O)，购自美国Selleck Chemicals公司。化浊解毒方颗粒(组方药材黄连、大黄、姜黄、蝉蜕、僵蚕、枳实、清半夏、白芍、柴胡、黄芩、干姜、佩兰)，由天津中医药大学第一附属医院药厂制备，批号津药制字(临)Z20130944。

1.3 试剂与仪器

1.3.1 试剂 碘[125I]胰岛素放射免疫试剂盒，购自北京北方生物技术研究所；游离脂肪酸测定试剂盒(比色法)，购自南京建成生物工程研究所；甘油三酯试剂盒(酶比色法)、胆固醇试剂盒(酶比色法)，均购自北京中生北控生物科技股份有限公司；一抗AhR(货号ER62618)，购自杭州华安生物技术有限公司；PPARγ、CD36、GLUT4、FGF21和、TNFα抗体(货号分别为ab272718、ab252923、ab33780、ab171941、ab66579)、蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂(批号分别为201111、201112)，均购自英国Abcam公司；苏木精-伊红(HE)染色试剂盒(货号G1003)，购自武汉赛维尔生物科技有限公司；中性树胶(批号ZLI-9555)，购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BCA 蛋白定量试剂盒(货号BD0028)、β-肌动蛋白(β-actin)单克隆抗体(货号AP0060)，均购自美国Bioworld Technology公司；SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液5×(货号P0015 L)，购自上海碧云天生物技术有限公司；山羊抗兔二抗(购自北京ANOLA，货号AN19618A)。无水乙醇(批号100092683)、二甲苯(批号10023418)，均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.3.2 仪器 SN697双探头全自动放免γ计数器(上海核所日环光电仪器有限公司)；7020型ISE全自动生化分析仪(日本日立公司)；TDZ5-WS低速多管架自动平衡离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司)；723S分光光度计(上海棱光技术有限公司)；170-3940型电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Trans-Blot型转膜仪(美国Invitrogen公司)；Amersham imager 600型超灵敏多功能成像仪(美国General Electric公司)；RM2235病理切片机、ASP200S全自动脱水机、G1150H加热石蜡包埋系统、DM3000正置光学显微镜(德国Leica公司)；Image-Pro Plus 6.0图像分析仪(美国Media Cybemetics公司)。

2 方法

2.1 分组与饲养 雄性ZDF(fa/fa)大鼠适应性饲养1周后，根据口服葡萄糖耐量实验(OGTT)合格者随机分为模型组与多氯联苯染毒组，染毒8周，根据OGTT结果将多氯联苯染毒组随机分为染毒组、阳性药组及化浊解毒方高、中、低剂量组，其间均以PMILabdiet5008专用饲料喂养，而雄性ZDF(fa/+)大鼠始终以普通饲料喂养。OGTT实验方案为过夜禁食不禁水8 h以上，次日上午7：00，检测大鼠空腹血糖、空腹体质量，50%葡萄糖以2 g/kg剂量灌胃，于0、60、90、120 min进行血糖检测，根据大鼠类型及前期预实验结果，将糖耐量正常及已形成糖尿病者剔除，糖耐量受损者纳入合格者范畴。

2.2 染毒及给药 染毒组大鼠以每天250 ng/kg剂量灌胃给予PCB126染毒，模型组、正常组大鼠灌胃等量橄榄油，连续8周。依据《中国临床药理学与治疗学》及课题组前期实验结果，确定化浊解毒方高、中、低剂量分别为6.0、3.0、1.5 g/kg[10-11]，阳性药组大鼠给予10 mg/kg CH223191灌胃治疗，模型组、正常组大鼠以等量生理盐水灌胃，连续4周。

2.3 取材及血清指标检测 给药结束后，大鼠过夜禁食不禁水8 h以上，次日腹腔注射麻醉后取材，腹主动脉取血后3 000 r/min离心15 min，收集血清，检测空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、空腹血清胰岛素(fasting insulin，FINS)、甘油三酯(triglycerides，TG)、胆固醇(cholesterol，TC)、游离脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平。对各组大鼠胰岛素抵抗指数(homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)进行计算[12]，公式为HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。切取大鼠附睾脂肪组织，生理盐水清洗脂肪表面，置于4%多聚甲醛中固定，制作常规石蜡包埋进行后续实验，剩余大鼠脂肪组织做好标记进行分装，迅速将其置于干冰泡沫盒中冷冻，再迅速转移放于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 HE染色观察大鼠脂肪组织病理学变化 大鼠新鲜脂肪组织固定于4%多聚甲醛中24 h以上，常规乙醇梯度脱水，透明，石蜡包埋，切取4 μm，常规脱蜡，复水后进行HE染色，在光学显微镜下观察各组脂肪组织形态，采用图像分析仪比较脂肪细胞平均大小。

2.5 Western blot检测大鼠脂肪组织AhR、PPARγ及下游CD36、GLUT4、FGF21、TNFα蛋白表达 取冻存的大鼠脂肪组织适量，剪碎后放入离心管，根据相应比例加入Western及IP细胞裂解液、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，超声破碎仪冰上破碎组织，4 ℃、14 000 r/min离心5 min，分离上清液，即为总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，4%～12% SurePAGE蛋白预制胶上样电泳分离蛋白，浓缩胶80 V电泳25 min，分离胶100 V电泳75 min，以PagePuler Prestained Protein Ladder所示的分子量切胶，甲醇浸泡PVDF膜，将目的蛋白转移至PVDF膜上，放入封闭液(5%进口脱脂奶粉)中，室温摇床缓慢封闭2 h，TBST洗涤，分别加入AhR(1∶1 000)、PPARγ(1∶1 000)、CD36(1∶1 000)、GLUT4(1∶1 000)、FGF21(1∶1 000)、TNFα(1∶1 000)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗涤5次，加入TBST稀释的HRP 标记的二抗(1∶10 000)孵育1 h，再用TBST洗涤，按照显影液说明书进行曝光。采用 Image J软件，分析各目的蛋白/β-actin的灰度值。

3 结果

3.1 化浊解毒方对大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数的影响 与正常组比较，模型组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数升高(P<0.01)；与模型组比较，染毒组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数升高(P<0.01)；与染毒组比较，化浊解毒方各剂量组与阳性药组大鼠上述指标均降低(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素及胰岛素抵抗指数Tab.1 FBGs,FINSs and HOMA-IRs in rats in each

3.2 化浊解毒方对大鼠血脂水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠 TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；与模型组比较，染毒组大鼠TC、TG、FFA水平升高(P<0.01)；与染毒组比较，化浊解毒方各剂量组与阳性药组大鼠TC、TG、FFA水平均降低(P<0.01)；化浊解毒方低剂量组大鼠TG水平虽有改善作用，但效果不显著(P>0.05)，见表2。

表2 各组大鼠血脂水平Tab.2 Blood lipid levels in rats in each group n=10)

3.3 化浊解毒方对大鼠脂肪组织病理学形态的影响 正常组大鼠脂肪细胞排列紧密，细胞较小且大小均一；与正常组比较，模型组、染毒组大鼠脂肪细胞增大(P<0.01)，排列紊乱，以染毒组更显著；与染毒组比较，化浊解毒方各剂量组及阳性药组大鼠细胞缩小(P<0.01)，中、高剂量组及阳性药组效果显著，见图1～2。

图1 各组大鼠脂肪组织病理学形态(HE，×100)Fig.1 Pathological morphologies of adipose tissue in rats in each group (HE，×100)

注：与正常组比较，**P<0.01；与模型组比较，##P<0.01;与染毒组比较，ΔΔP<0.01。图2 各组大鼠脂肪细胞大小Fig.2 Fat cell sizes of rats in each

注：A为正常组，B为模型组，C为染毒组，D为阳性药组，E～G分别为化浊解毒方低、中、高剂量组。图3 各组大鼠脂肪组织AhR/PPARs通路蛋白表达Fig.3 Expressions of AhR/PPARs pathway proteins in adipose tissue of rats in each group

3.4 化浊解毒方对大鼠脂肪组织AhR、CD36、TNFα蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表达升高(P<0.01)；与模型组比较，染毒组大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表达升高(P<0.01)；与染毒组比较，化浊解毒方中、高剂量组及阳性药组大鼠AhR、CD36、TNF-α蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，见图3、表3。

表3 各组大鼠脂肪组织AhR、CD36和TNF-α蛋白表达Tab.3 Expressions of AhR,CD36 and TNF-α proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

3.5 化浊解毒方对大鼠脂肪组织PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表达降低(P<0.01)；与模型组比较，染毒组大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表达降低(P<0.01)；与染毒组比较，化浊解毒方中、高剂量给药组及阳性药组大鼠PPAR-γ、GLUT4、FGF-21蛋白表达均升高(P<0.05，P<0.01)，化浊解毒方低剂量组仅GLUT4蛋白表达升高(P<0.05)，PPAR-γ、FGF-21蛋白表达无明显变化(P>0.05)，见图3、表4。

表4 各组大鼠脂肪组织PPAR-γ、GLUT4和FGF-21蛋白的表达Tab.4 Expressions of PPAR-γ,GLUT4 and FGF-21 proteins in adipose tissue of rats in each n=3)

4 讨论

芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)又名二恶英受体，是一种配体激活转录因子，主要在脂肪和肝脏中表达。研究发现，PCB126可特异性激活AhR影响糖脂代谢、激发炎症进而导致胰岛素抵抗[13-14]。白细胞分化抗原36 (cluster of differentiation 36,CD36)是一种高度糖基化的单链跨膜蛋白，能够引起脂质代谢紊乱和炎症[15-16]，是AhR下游的主要靶点[17]。本实验发现，与模型组比较，染毒组脂肪组织的AhR表达升高，与胰岛素抵抗相关的糖脂代谢指标、炎症因子TNFα及CD36的表达也升高，可能与PCB126激活AhR相关；与染毒组比较，化浊解毒方组AhR、TNFα、CD36及糖脂代谢指标表达下降，胰岛素抵抗显著改善，且中、高剂量组及阳性药组效果显著。阳性药CH223191是在脊椎动物中发现的一种效且特异性的AhR受体拮抗剂，能有效抑制PCB126介导的核易位和AhR与 DNA 结合[18-19]。因此，CH223191有效阻止了PCB126诱导的AhR基因的激活，改善胰岛素抵抗，化浊解毒方显示出同等的效果，且呈现一定的量效关系，说明化浊解毒方可能具有类“AhR受体拮抗剂”的作用。

葡萄糖转运蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)可促进机体从外周摄取葡萄糖，调节生物体糖稳态[20]。研究发现，GLUT4为AhR下游的靶点，AhR可通过抑制 GLUT4的表达与活性，诱发胰岛素抵抗[21-22]。成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor-21，FGF21)具有改善胰岛素抵抗及调节血脂的功能，受AhR的调控，主要在脂肪表达[23]。结果显示，染毒组GLUT4与FGF21表达下调，说明两者可能受到AhR的抑制。

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)在维持能量平衡和抑制炎症中发挥核心作用。PPARγ(主要在脂肪表达)是其中一个亚型，可增加脂质在脂肪中的存储，减轻脂质在非脂肪组织的沉积，同时调节糖代谢和抑制炎症。持续性有机污染物特异性激活 AhR 的多个下游重要靶点也受到 PPARs 调控。PPARs一方面受AhR的调控，另一方面可活化GLUT4，改善糖代谢，对CD36、TNF-α也有调节作用。研究发现，PPARγ能刺激脂肪分泌 FGF-21 通过对抗糖脂毒性及增加脂肪的胰岛素敏感性来改善胰岛素抵抗；同时，FGF21还可刺激脂肪分泌具有胰岛素增敏作用的脂联素[24]。本研究发现，染毒后，PPARγ及下游的GLUT4、FGF21均出现下调，一方面跟AhR的抑制相关，另一方面可能为PPARγ调控失衡；给药后，3种蛋白均出现不同程度的上调，中、高剂量组效果显著。前期实验表明，化浊解毒方能通过调节 PPARγ的表达改善胰岛素抵抗[11]。本实验进一步发现，化浊解毒方改善胰岛素抵抗的机制可能是一方面抑制脂肪组织AhR及下游CD36与TNFα的表达；另一方面促进PPARγ及GLUT4与FGF21的表达。病理学研究发现，染毒组的脂肪细胞较模型组增大，给药后，脂肪细胞减小。研究发现，脂肪细胞的大小与脂肪中TNFα表达呈正相关[25]。病理学结果说明，PCB126可加重脂肪的炎症，经化浊解毒方处理后，脂肪炎症及胰岛素抵抗得到改善。因此，化浊解毒方改善染毒大鼠脂肪胰岛素抵抗的机制与其调控AhR/PPARs通路相关。