黄敏，刘若雪，林鑫，韩晓晨，何俊瑛，赵辉，燕犁天，邹月丽，卜晖

软脑膜转移(LM)，又称“脑膜癌病”、“癌性脑膜炎”，是指癌细胞扩散到软脑膜，蛛网膜和CSF空间所致的恶性疾病。LM往往发生在恶性肿瘤的晚期阶段，有很高的致残率和病死率。实体肿瘤LM最常见的来源是肺癌，乳腺癌和黑色素瘤。尽管肺癌和乳腺癌更为普遍，但黑色素瘤扩散到CNS的风险最高[1-2]。据估计约30%的转移性黑色素瘤患者会发生CNS受累(尸检时高达75%)，转移至软脑膜空间的患者约占5%[3]。近年来LM的发病率呈逐渐上升的趋势，可能是影像学技术的改善，较低的诊断阈值，以及癌症患者生存率提高和许多抗肿瘤药对血液-CSF屏障渗透性有限的结果[4-5]。黑色素瘤LM患者的预后很差，平均总生存期为8～10周[3]。Ferguson等[6]对178例黑色素瘤LM患者进行生存预后分析表明尽早正确诊断是与总生存期显著相关的积极因素。因此，在未出现严重神经功能缺损之前，尽早准确的诊断，为患者提供更好的、及时有效的治疗方式，是提高这部分患者总体生存期的关键环节。本文主要讨论黑色素瘤LM诊断方面的新进展，强调了开展CSF细胞学检查的必要性，并阐述了其他新兴CSF分析技术的最新数据，为临床提供依据。

1 LM的生物学基础

软脑膜空间是由紧贴大脑和脊髓表面的软脑膜和蛛网膜组成的空间，其间充满循环流动的CSF。在正常健康状态下，CSF内几乎是无细胞的，可有少数的淋巴细胞和巨噬细胞。转移性癌细胞主要通过：(1)脉络丛的动脉循环；(2)贝特森丛或桥接静脉的静脉循环；(3)沿颅神经或脊神经根的神经周围间隙；(4)从脑实质通过神经胶质足突直接浸润等四种途径进入该空间[2,7-8]。但有研究[8]表明在转移性黑色素瘤中，沿神经周围的迁移很少见。一旦进入CSF，癌细胞就可以在整个CNS中扩散并在软脑膜空间循环，种植在软脑膜上，按照“种子和土壤”假说来促进肿瘤细胞的生长和增殖[9]。

CSF中有丝分裂原少，蛋白质、葡萄糖和细胞因子含量很低[10]。与其他转移部位(如脑组织)相比，软脑膜空间在转移微环境方面明显不同。进入CSF的转移细胞面临着营养和生长支持信号相对较差的无细胞环境[11]。Boire等[11-12]通过研究四个不同LM模型发现CSF中的癌细胞均上调了补体成分3的产生，导致血CSF屏障破坏，可以促进血浆中生长因子等营养物质进入CSF，从而促进癌细胞在该特殊环境中的生长。最近一项对来自黑色素瘤LM患者的CSF进行蛋白质组学分析的研究[13]显示，CSF中与先天免疫，蛋白酶介导的损伤和胰岛素样生长因子(IGF)相关信号有关的通路均有表达增加[如转化生长因子β(TGF-β)表达增加，PI3K/ AKT通路上调等]，可能促进了癌细胞的增殖。

软脑膜空间一直以来被认为是具有“免疫特权”的部位，到达该部位的癌细胞可以逃避免疫监视[8,14]。然而，最近的小鼠模型实验[15]发现CNS内存在与硬脑膜窦伴行的脑膜淋巴管系统，并可将CNS来源的抗原引流至颈深部淋巴结诱导免疫反应。未来对癌细胞如何躲避免疫监视的探索将会促进新型诊疗手段的研发。

2 黑色素瘤LM的诊断

目前LM的诊断主要基于临床评估，脑脊髓MRI和CSF检查。根据欧洲神经肿瘤协会-欧洲肿瘤内科学会(EANO-ESMO)指南，CSF中检测到肿瘤细胞可确诊LM。对于已知或可能患癌症的患者，存在典型的临床症状和影像学征象则提示可能为LM[16]。CSF细胞学仍是目前确诊脑膜癌病的“金标准”，也是监测治疗反应的主要手段。2020年CSF细胞学临床规范应用专家共识也指出CSF细胞学对脑膜癌病的诊断具有重要意义，并建议将CSF细胞学作为临床CSF检查的常规检查或者一线检查，且应积极开展[17]。

随着技术进步，LM检测的手段越来越多，敏感性及特异性有所提高。但黑色素瘤LM的诊断仍然是一个巨大挑战。临床医生需要在患者的一般状况改变以及发生多发，严重或固定的神经功能缺损之前进行LM诊断，且可能在整个过程中，需临床医师适当联合多种检测手段来明确诊断。

2.1 临床表现 黑色素瘤LM患者的临床表现无特异性，可因恶性细胞累及CNS的不同区域而表现为不同的症状。常见症状包括头痛、颅神经缺损(如视力障碍、复视、听力下降)、精神疾病发作和癫痫发作，也可出现神经根疼痛、背痛或马尾神经综合征。此外，肿瘤细胞生长可影响CSF循环，导致阻塞性或交通性脑积水的症状，如恶心、呕吐、嗜睡等[18-19]。由于非特异性的多形式和多灶性神经系统症状和体征，必须进行鉴别诊断，考虑的疾病应包括但不局限于其他转移性癌、淋巴瘤、白血病、神经结节病、急性弥漫性脑脊髓炎、感染性病因和其他自身免疫性疾病等。这些疾病的表现与之类似，会使诊断进一步复杂化，需应用其他检测手段加以鉴别。

2.2 影像学检查 目前钆剂增强的脑和脊髓MRI(MRI-Gd)是评估可疑LM患者的首选影像学检查[20]。由于黑色素具有顺磁性，黑色素瘤在MRI上可能表现为T1WI高信号，T2WI等信号以及注射钆剂后的明显增强[21]。黑色素瘤LM可表现为大脑半球皮质沟和小脑叶的结节样和曲线样增强，或颅神经和基底池的强化，也可表现为沿脊髓表面和/或马尾神经根的平滑增强和结节增强。这些MRI增强表现并非特异性，许多良性的软脑膜疾病也可以导致类似结果，这使得仅通过影像学来诊断LM具有挑战性[8]。但是MRI结果阴性也不能排除LM的诊断。应注意的是，影像学检查尽量在腰穿之前进行，以避免因短暂性颅内低压或药品对脑膜的刺激而引起潜在的医源性硬脑膜和软脑膜增强。此外，有研究[22]表明免疫治疗可能会引起“假性脑膜炎”，导致MRI假阳性。18F-脱氧葡萄糖PET-CT进行全身扫描可显示出高代谢灶的部位用于鉴别转移性黑色素瘤和原发性CNS黑色素瘤[23]。

2.3 CSF分析 与CNS其他部分相比，CSF是最容易获得的介质，可以直接从CNS的不同部分获取多种与疾病进展和对治疗反应有关的肿瘤标志物[24]。因此CSF的多模式分析可提供更直接、更准确的诊断依据，也是监测疾病变化及治疗反应的一个更便捷途径，已成为现代LM诊断工作的重要组分。

2.3.1 CSF常规检查 在条件允许的情况下，患者应尽可能行腰椎穿刺术，不仅可以提供诊断且可评估治疗反应。在超过90%的LM病例中观察到标准CSF常规检查异常。LM患者的CSF常规分析往往显示颅内压增高，白细胞升高(以淋巴细胞为主)，CSF蛋白水平升高，葡萄糖水平降低[2]。CSF细胞学仍是目前诊断LM的临床金标准，其因操作简便，特异性高，患者接受度高等特点在临床广泛应用。当在CSF中发现细胞体积大，胞膜不规则有突起，细胞质嗜碱性有空泡，核质比失调，可见单核或多核，胞内黑色素极其丰富常覆盖细胞核的典型黑色素瘤细胞时即可诊断黑色素瘤LM[25]。在最终诊断为LM的患者中，初次检查时高达45%的细胞学为阴性。通过第二次CSF分析，其敏感性可达到80%[26]。增加CSF送检量，尽快处理标本，多次送检等可提高细胞学检测的灵敏度[2,12]。CSF细胞学检测对于LM诊断的敏感性及特异性高于影像学及临床症状的提示。适当提早CSF细胞学检测，将有效提高诊断效率，并对患者的治疗措施及预后产生更为积极的影响。CSF免疫细胞化学检测可以通过抗原抗体反应发现CSF中的黑色素瘤细胞，即表达S-100(+)，HMB45(+)，MelanA(+)和EMA(-)的细胞[27]。有研究[28-29]表明，HMB45和MelanA仅在黑色素瘤细胞特异表达，MelanA的诊断敏感性为71%，HMB45的诊断敏感性可达85%。

2.3.2 CSF高级检测 “液体活检”的定义是对来自生物流体的肿瘤细胞或核苷酸进行实时采样。CSF作为一种可用于“液体活检”的生物流体，已被证明具有明确CNS肿瘤遗传学，监测肿瘤进展，和改变患者临床治疗的潜力[30]。目前主要的两种液体活检方法是循环肿瘤细胞(CTC)分析和游离肿瘤DNA(ctDNA)测序，其他方法包括游离细胞RNA(cfRNA)、外泌体、蛋白质组学和代谢组学[31-32]。

CTCs是指那些从肿瘤起源部位或转移性沉积物脱落后转移到血液循环或其他生物流体中的细胞。CTC是转移的直接种子，其诊断意义受到研究人员和临床医生的高度关注。但是CTC离开原发部位，进入循环并侵袭转移性定植靶器官的过程非常复杂，其机制尚未完全了解[30]。目前，CSF中CTC的检测已用作实体瘤LM的辅助诊断策略。用于检测CTCs的技术方法包括以下几种：CellSearch技术平台、RT-PCR、免疫荧光原位杂交(FISH)技术、流式细胞术等[24]。有研究[33-36]已经通过这些技术检测到乳腺癌、肺癌LM患者 CSF中的恶性细胞。Le Rhun等[26]通过改良后的Cellsearch技术平台检测到7例黑色素瘤LM患者CSF中具有典型形态的黑色素瘤细胞即具有CD146(+)；4′,6-二咪基-2-苯基吲哚(DAPI)(+)；抗荧光黑素瘤相关抗原(HMW-MAA)(+)；CD34(-)和CD45(-)这些免疫表型的细胞，表明CellSearch可实现CSF中黑色素瘤细胞的连续监测。Torre等[37]通过CellSearch平台对20例实体瘤LM患者(包括2例转移性黑色素瘤患者)的CSF进行检测，显示其诊断LM的灵敏度为88.9%，特异性为77.8%。这些实验都充分说明CTC的检测可以作为LM的早期诊断，并可精准定量，了解肿瘤负荷，评估LM治疗反应。

近几年还处于临床前阶段的最有前景的检测CSF CTCs的方法是光声流式细胞术(PAFC)，与其他诊断技术相比，它表现出超灵敏的分子检测和不同体液(例如血液、淋巴液和CSF)中计数单细胞的能力。有研究[24]使用乳腺癌转移癌的临床前模型报道了PAFC首次成功检测出CSF中CTCs的能力。最近，Edgar等[38]对38例晚期黑色素瘤患者进行血液CTCs检测表明，PAFC可以检测Ⅰ～Ⅲ期黑色素瘤患者血液中极少数的CTCs，具有预测转移性疾病发生的潜力，成功地证明了PAFC的临床意义。未来光声流式细胞术在黑色素瘤LM患者中的应用将可以提前检测到处于亚临床状态的转移性疾病，并尽早针对极少数的CTC进行单细胞治疗，阻止转移性疾病的发生。

CtDNA是从原发性或转移性病变中的坏死或快速生长的细胞和/或循环肿瘤细胞中脱落的，是一个完全由肿瘤衍生的循环游离DNA(cfDNA)子集[30]。血清ctDNA检测的限制是血清中ctDNA的含量相对稀少，ctDNA与cfDNA的比率很低，而CSF中非肿瘤来源的DNA含量较低，因此CSF中ctDNA与cfDNA的比率比血清中的高得多，从而更容易检测到等位基因频率较低的突变[39]。CSF ctDNA检测的临床应用在于，一是可以为细胞学阴性的LM患者提供辅助诊断;二是确定转移癌细胞的基因改变，给予最佳靶向治疗[40]。目前用于CSF ctDNA检测的技术有微滴式数字PCR(ddPCR)和二代测序技术(NGS)。Ballester等[41]通过ddPCR和NGS检测了来自黑色素瘤LM患者的CSF ctDNA相关突变情况，发现ddPCR、NGS与MRI结果之间有很强的相关性;这种相关性强于CSF细胞学检查和MRI结果之间的相关性，这表明ddPCR、NGS在分析黑色素瘤LM患者CSF方面优于细胞学及MRI检查。Li等[42]通过观察1例黑色素瘤LM患者在整个临床病程中不同时期的CSF ctDNA变化趋势得出，较高的ctDNA量与更严重的症状相对应，并通过对ctDNA全外显子测序发现突变基因给予靶向治疗，表明来自CSF中肿瘤细胞的ctDNA具有特征性突变，这些突变对于选择靶向治疗剂或监测治疗反应具有临床意义。

但CSF CTC和ctDNA的存在均不足以诊断LM。因毗邻软脑膜间隙或脑室系统的实质性病变可将CTC或ctDNA释放到CSF中，而没有活细胞侵入该间隙。在高达63%无LM的实质性脑转移患者中，通过ddPCR在其CSF中也检测到了与肿瘤相关的突变(如BRAF、MET)。因此，CSF CTC的存在和CSF ctDNA中肿瘤相关突变的存在可能反映了脑转移和(或)LM[43-45]。有关这些检测技术的敏感性和特异性仍有待大量临床试验的评估。

当侵入软脑膜空间时，癌细胞会引起转移微环境的相应改变。最近一些研究[2,46]表明CSF中部分通路表达的改变可能与癌细胞转移并在软脑膜空间增殖有关。因此，CSF蛋白质组学分析，尤其是与转移过程有关的蛋白，可能具有潜在的诊断和预后价值。Smalley等[13]对16例黑色素瘤LM患者的45份连续CSF样本进行多重免疫测定和质谱分析得出软脑膜环境中许多关键途径表达有所增加，如TGF-β水平的升高与较差的临床表现状态及更短生存期有关，多种补体成分(包括C2、C3、C6、C5、C9、C8α、C8β和C8γ)的表达增加可能表明患者软脑膜炎性活动的增加，这可能导致一些与该疾病相关的严重神经系统症状的发生。CSF环境中的蛋白质/转录组学分析可能是LM患者生存预后的相关因素，全方位的检测可用于评估治疗效果，提示预后。

2.3.3 CSF生物标志物 生物标志物是指可以客观测量和评估疾病过程或对治疗反应特征的指标。当前，所有可用于LM的生物标志物均基于CSF研究。目前有关黑色素瘤LM的研究[47]已显示某些非特异性标记物，例如β-葡萄糖醛酸酶、乳酸脱氢酶(LDH)和血管内皮生长因子(VEGF)，已可用作黑色素瘤LM诊断和评估治疗反应的间接指标。有研究[47]表明，黑色素瘤LM患者CSF中β-葡萄糖醛酸苷酶和LDH水平显著高于正常CSF水平，并与病程发展及治疗反应有一定相关性。VEGF已被证明在LM患者的CSF中有所升高[48]。Herrlinger等[49]通过比较39例LM患者(其中包括7例转移性黑色素瘤患者)连续CSF标本得出LM患者诊断时的VEGF水平显著升高(中位数359 pg/ml)。在可获得连续CSF样品的患者中，VEGF水平与临床病程相关，治疗缓解后显着降低，复发时有所增加，具有预测疾病发展，指导早期治疗的潜力。Groves等[48]通过分析89例LM患者(包括13例黑色素瘤LM)的CSF发现，升高的VEGF水平对恶性肿瘤的预测敏感性为67%～75%，特异性为95%～100%，表明CSF VEGF水平可作为高危LM黑色素瘤患者早期诊断的生物标志物。但这些标记物在诊断黑色素瘤LM时并非特异性，未来仍需大量的临床实验去探索新的高特异度和敏感度的生物标记物，更好地预测疾病发展及监测治疗反应。

2.4 软脑(脊)膜活检 如果无法通过细胞学、影像学及其他辅助检查等方法诊断LM，并且已经排除了慢性脑膜炎的常见原因，对于高度怀疑LM的患者则应根据有症状的神经部位和/或MRI上造影剂增强区域来进行软脑脊膜活检[50]。但由于脑膜活检的创伤较大，累及部位的特殊性及新型诊断技术的不断发展，目前LM的诊断往往很少需要进行脑膜活检[51]。

3 结论

黑色素瘤患者LM的发病率正在增加。虽然针对LM的治疗已取得进展，但该群体的整体生存期仍然较短，其中及早诊断是提高生存期的关键环节。CSF细胞学是目前诊断LM最基本、可靠且操作性强的手段，同时不断发展的诊段工具和肿瘤标记物也可以为早期诊断和治疗提供帮助。总之，多模式的CSF分析可以为LM患者尽早提供诊断以及实现个体化治疗。未来方向可以针对CSF单个肿瘤细胞进行检测并治疗，在萌芽期阻断LM的发生。