马亚博， 吴 霜, 马 慧, 原筱潭, 侯海蓝田, 徐金瑞, 杨 易

(宁夏大学 生命科学学院,宁夏 银川 750021)

随着人类社会的发展和进步,生存环境和生活压力导致适龄人群不孕不育率逐年上升[1]．人类的生殖健康问题成为社会关注的热点问题.辅助生殖技术的发展,在一定程度上缓解不孕不育率,但依然还有许多理论和技术难题是未知的,特别是女性不孕机理亟待探索[2]．卵巢作为雌性哺乳动物的生殖器官,承载着产生成熟卵子、繁衍子代的重要任务[3]．卵泡作为卵母细胞发生与发育的基本功能单位[4],负责雌性哺乳动物顺利完成生殖活动．卵泡的数量在出生前后确定而在成年后不再更新,且随着年龄的增长卵泡的数量逐渐消耗殆尽．因此,卵泡的形成、激活、发育及成熟直接决定了雌性哺乳动物的生殖资源和生育能力[5].而卵泡的异常激活和发育都会造成卵巢早衰、多卵巢囊肿综合症等女性生殖疾病．大量的研究表明,Wnt信号在卵泡发育、黄体形成和类固醇生成等方面发挥至关重要的作用．虽然近年来对Wnt信号在卵泡发育调控中作用的认识有了很大的提高,但对于Wnt信号在成熟卵巢中的生理病理作用仍不清楚．近年来,相关学者在卵泡形成、激活及发育方面进行了广泛的探索,但卵巢卵泡的研究仍然停留在各种激素以及部分信号通路,而关于卵泡形成和发育机制的研究较少[6].

1 Wnt信号

Wnts家族(Wingless-typeMMTV integration site families,Wnts)是一个广泛的糖蛋白分子家族[7]．Wnts通过β-catenin依赖和β-catenin独立通路调节细胞生长和分化的重要过程,包括细胞增殖、细胞迁移、细胞命运规范和细胞凋亡[8]．该信号通路异常激活或抑制都会造成异常生理状态或疾病的发生[9]．

目前,对于经典Wnt/β-catenin信号通路的研究较清楚,该通路的许多成分在卵泡发育中有所表达．非经典Wnt信号通路是独立于β-catenin的信号转导途径,其激活的信号通路比经典通路更复杂,且种类众多[10]．关于非经典Wnt 信号通路的研究不多,其具体途径和作用机制尚不清楚．

2 Wnt信号通路与卵泡发育

卵巢是一个多室器官,卵泡在其中生长,培育成熟的可受精的卵母细胞,并在排卵时释放它们[11]．卵巢也是一种内分泌组织,分泌类固醇激素,如雌二醇和孕酮,用于准备着床和怀孕所需的生殖道．为了使这些功能发生,必须发生一系列高度协调的支持卵泡发育的事件．从腔前到腔内和排卵阶段,卵巢卵泡的生长和发育过程涉及多个因素,包括多种激素、卵巢内生长调节因子和类固醇等．除这些因素外,Wnt信号通路在颗粒细胞中表达,它们由促性腺激素调节,并在卵泡发育、排卵和黄体形成过程中发挥作用．

受Wnt蛋白家族调控的各种生理过程显示,卵巢中Wnt信号成分的存在和活性并非出乎意料[11]．研究表明,许多Wnt家族成员调控整个卵泡发育的表达,在卵泡形成、生长和排卵过程中存在潜在作用．目前,对于Wnt2,Wnt4配体在卵泡中的表达研究较清楚．

Vainio等首次揭示Wnt4在卵巢中的表达[12],实验证实,在出生前敲除Wnt4基因可使小鼠丧失大部分卵子[13]．进一步的研究证明,β-catenin介导Wnt4的发生,Wnt4调节腔内卵泡成熟和类固醇生成．与Wnt配体相似,Fzd受体在卵泡成熟、排卵和黄体发育的特定阶段都有所表达,在颗粒细胞中已经检测到许多Fzd受体,但与Fzd受体在成年卵泡发育中的生理相关性知之甚少．Hsieh等发现,Wnt4在小鼠和大鼠卵泡发育各个阶段的颗粒细胞中表达[14],但体外受精前从卵母细胞获得的人卵丘颗粒细胞中并未检测到Wnt4[15]．在成年啮齿动物颗粒细胞中,Wnt4在人绒毛膜促性腺激素(HCG)刺激下升高,在黄体中保持升高[14]．使用孕马血清促性腺素对母猪进行发情同步,与对照组相比,黄体组织中Wnt4的表达增加[16]．Boyer等发现,小鼠颗粒细胞中Wnt4的靶向缺失导致卵巢较小[17],窦状卵泡在42 d时发育不全．这些结果表明,Wnt4是控制卵巢生长和成熟的重要信号[8,18]．

研究显示,Wnt2作为Wnts家族的重要成员,在未成熟大鼠卵泡发育各个阶段的颗粒细胞中均有表达[19],提示Wnt2对卵巢卵泡发育有积极的调控作用[20]．Wang等揭示,Wnt2在小鼠卵丘和壁颗粒细胞以及大的、健康的窦前和腔内卵泡中具有最大的免疫反应[21]．免疫组化显示,在小鼠卵泡发育的整个过程中,Wnt2在卵巢壁颗粒细胞和卵丘细胞中均有表达,在人卵丘细胞上也有该因子的表达．Wnt2通过其受体FZD9信号调节人卵丘细胞中的β-catenin途径,β-连环素进入细胞膜并促进其形成黏附连接以调控人卵泡的发育[21]．

3 Wnt信号通路在卵巢疾病中的研究

3.1 卵巢早衰

卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指女性在40岁之前出现卵巢功能衰竭的现象[22].卵巢早衰是造成女性生育能力下降甚至丧失的重要原因之一． 影响卵巢早衰的病因复杂,涉及方面广泛,其中包括卵泡功能失调、卵泡闭锁或耗竭过快等．

卵巢主要功能之一是类固醇激素的生成,而卵巢类固醇激素的形成受Wnt信号通路的严格调控.研究表明,可通过对卵巢类固醇生成分子的机制研究揭示女性生殖疾病,如卵巢早衰和卵巢癌的发病机制．Wnt/β-catenin途径可能是通过促性腺激素(GTH)信号来调节类固醇的生成．研究表明,Wnt4信号不仅在胚胎发育过程中,而且在出生和成年后均控制着卵巢功能．Wnt4介导的卵泡成熟调控涉及抗苗勒氏管激素(Anti-Mullerianh hormone,Amh)．Wnt4协调颗粒细胞极性和卵泡内生物分子(biological molecular,BM)组分的积累,且在卵巢体细胞中Wnt4信号受损导致POF[23]．Shan等通过敲除小鼠Wnt4基因[18],并使用新型Wnt4 (mCherry) 敲入小鼠,在2个模型中,卵巢卵泡发生损伤,女性生育能力严重下降,Wnt4缺乏最终导致卵巢早衰．由此可知,Wnt4基因在卵泡发育阶段至关重要,是促进卵巢早衰发生、发展的关键因子[18]．

3.2 卵巢癌

卵巢癌(ovariary cancer,OC)是指发生在卵巢的恶性肿瘤性疾病,且组织学类型多样,主要指上皮来源,具有病情发展迅速、病死率高的特点．目前,对于卵巢癌的治疗主要依靠手术和化疗技术,但治疗效果并不显著,临床上也未发现完全有效的抗癌药物．因此,寻找新的治疗方法和药物靶点一直是研究卵巢癌的热点．

Wnt/β-catenin信号转导通路是目前公认的肿瘤发生的重要途径之一,该通路的异常激活会促进细胞增殖和癌变．β-catenin通过调控细胞增殖和凋亡基因影响卵巢癌的发生和发展[24]．李委佳等的研究显示,抑制基因N-myc下游调节基因4(N-myc downstream regulated gene 4,NDRG4),可抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭[25],作用机制与抑制Wnt/β-catenin细胞信号通路的活性有关．龚建明等发现,从红花中分离得到的羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A,HSYA)能够促进肿瘤抑制因子menin表达[26],导致β-catenin降解,使其在细胞核中的积累量减少,从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的活性,使下游癌基因表达减少,进而抑制卵巢癌细胞的增殖,诱导癌细胞凋亡．冯珊珊等的研究证明[27],沉默赖氨酰氧化酶样蛋白2(lysyl oxidase-like2,LOXL2) 通过抑制Wnt/β-catenin信号转导通路的活性进而抑制癌细胞的增殖,最终诱导癌细胞的凋亡,说明LOXL2可能成为治疗卵巢癌的潜在靶点．对Wnt/β-catenin信号通路中关键因子进行的研究结果显示,这些调控因子有望成为治疗卵巢癌的药物靶点．

研究显示,Wnt,Notch信号通路在胚胎发育和肿瘤发生方面存在相互作用[28].Bocchicchio等发现[29],Notch,β-catenin信号共同参与卵巢癌细胞的功能,抑制卵巢癌细胞的增殖和迁移,且少部分可在没有Wnt信号的情况下上调Notch-Jagged1配体实现．Wnt ,Notch信号通路在卵巢癌细胞功能中的相互作用,为日后临床上治疗卵巢癌疾病提供了参考．

近年来,关于卵巢疾病发生发展的相关机制研究越来越多,并且获得了一定的理论依据．在卵巢疾病的治疗方面,激素已经取代了最早的治疗方法,但在临床治疗中仍未取得根本性的有效成果,卵巢癌和卵巢早衰等疾病也未发现绝对有效的治疗手段.如何利用Wnt信号通路调控机制预防和治疗卵巢疾病是未来主要的研究方向．

4 Wnt信号与其他卵泡细胞

4.1 Wnt信号通路与原始卵泡的形成

原始卵泡的形成作为卵泡发育的第一个阶段,其正常形成和激活决定雌性哺乳动物终身的生育能力.出生前后形成的原始卵泡库容量即为雌性哺乳动物终生可利用的生育资源．

牛万宝等的研究表明,JNK,Wnt4在卵母细胞中均表达,JNK信号通路和Wnt4相互作用,共同调控合胞体的破裂和原始卵泡的形成[30]．GSK-3β通过严格的胞内底物活性调控,在不同组织中控制细胞命运,其活性受到多个细胞生长信号通路的调控．尽管GSK-3β在胞内维持着持续激活的状态,但仍然能被短暂的钙浓度升高所激活.GSK-3β活性也可被一些信号通路抑制,如Wnt,P13K/Akt通路等.抑制GSK-3β对小鼠胚胎期卵巢合胞体破裂及原始卵泡形成没有显著影响[31]．Bothun等发现[32],Wnt信号从妊娠早期到中期在成人卵巢中持续表达,并保留在成人卵巢中,但经典Wnt信号仅在原始卵泡卵母细胞中存在．

虽然对原始卵泡形成的作用机制及调控因子知之甚少,但其在卵泡发育和决定雌性哺乳动物生殖力等方面的重要性不可否认,研究原始卵泡形成的作用机制和关键因子可能是解决女性生殖障碍的关键．

4.2 Wnt信号与颗粒细胞

颗粒细胞(granule cells,GC)被称为守护卵子的“羽林军”,是组成卵泡的重要细胞之一,对卵泡的发育和成熟起到保护作用．

赵妙妙等发现[33],绵羊卵泡颗粒细胞的发育成熟受Wnt信号通路与FSH共同调节．杨有福的研究显示,在猪卵巢卵泡发育过程中[34],颗粒细胞和卵巢卵泡的发育活动与褪黑素、PI3K通路和Wnt/β-catenin通路密切相关．有报道microRNA-10家族在卵泡形成过程中干扰颗粒细胞的正常发育[35].Tu等的研究进一步证明,miR-10a通过协同调节PTEN,Akt和Wnt途径促进颗粒细胞瘤(granulosa cell tumor,GCT)的发生与发展[35]．张深的研究证明[36],过表达gga-miR458b-5p拟合物会抑制鸡卵泡颗粒细胞内β-catenin蛋白的合成以及细胞增殖,进而影响Wnt/β-catenin信号通路中一些相关基因的表达．薛丽娜等发现[20],Wnt2蛋白在绵羊卵泡内膜细胞、颗粒细胞以及卵丘细胞内均有表达,Wnt2是通过经典Wnt信号通路促进绵羊卵泡颗粒细胞的生物学功能．

5 Wnt5a与恶性肿瘤

Wnt信号通路在肿瘤的发育、动态平衡和疾病中起着重要作用,Wnt信号异常在多种癌症类型中普遍存在[37]．随着对恶性肿瘤的深入研究,Wnt5a也受到广泛的关注． Wnt5a是一种激活非经典Wnt信号通路分支的配体,可作为肿瘤抑制因子促进癌细胞的侵袭和迁移,其异常表达或抑制都会产生许多不良后果．除了子宫内膜癌、乳腺癌和宫颈癌外,Wnt5a还参与许多其他肿瘤和疾病的表达,但其分子作用机制尚未完全阐明．

子宫内膜癌(endometrial carcinomas,EC)是妇科常见的恶性肿瘤.与正常组织相比,子宫内膜癌中Wnt5a显示低表达[38]．经典Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤发生中起着重要的调控作用,而非经典Wnt5a-ROR1信号是Wnt信号通路的重要调控因子,ROR1通过上调Wnt5a和刺激Wnt/β-catenin信号通路作用于EC细胞[39]．乳腺癌是乳腺上皮细胞在多种致癌因子的作用下,发生增殖失控的现象．研究表明,Wnt5a是乳腺癌的一种抑制因子,其表达的缺失会造成许多不良后果.但也有研究表明,Wnt5a具有致癌性,Wnt5a在乳腺癌中的作用仍然存在一些争议．Zeng等的研究证明[40],Wnt5a的作用取决于关键受体的可用性和不同细胞类型之间的相互作用,其在乳腺癌中表达也可能取决于这些因素．季晓辉的研究表明,乳腺癌组织中Wnt5a低表达、 β-catenin高表达[41],乳腺癌的淋巴结转移和临床分期受Wnt5a,β-catenin的共同调节,这为诊断和治疗乳腺癌提供了潜在靶点．宫颈癌也是常见的妇科恶性肿瘤,已有研究报道,经典Wnt信号转导通路与宫颈癌的发生与发展密切相关,但对于非经典Wnt信号通路在宫颈癌中的作用机制仍不完全清楚．Lin等的研究证明,Wnt5a在宫颈癌组织中高表达[42],宫颈癌的转移和临床预后与Wnt5a密切相关．平静等的研究表明[43],Wnt5a可能参与宫颈鳞状细胞癌的侵润、转移等过程．文丽芳等的研究表明,5-氟尿嘧啶通过Wnt/β-catenin信号通路促进HPV阳性宫颈癌细胞凋亡[44]．卢柳媚等发现,miR-137通过靶向Wnt5a抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[45]．因此,Wnt5a,Wnt信号通路有望成为治疗女性生殖疾病的关键因子和潜在靶点．

6 结语

Wnt信号通路在生殖系统中的功能复杂,在调节卵泡的正常生长、成熟、排卵和黄体形成过程中都起重要作用．Wnt信号通路不仅在人体卵泡发育中具有一定的调控作用,还在其他哺乳动物卵泡细胞中起重要作用．