摘 要：为探索枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸的最佳条件。以玉米秸秆与麸皮配比、尿素添加量、培养基初始pH为试验因素，以发酵产物腐植酸含量为指标，根据单因素试验结果选定因素水平，采用Box-Benhnken试验设计法，研究各因素交互作用及其对发酵产腐植酸的影响，拟合获得二次多项式回归模型。结果表明：枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸的最佳条件为玉米秸秆与麸皮配比0.95∶1、尿素添加量0.81%、培养基初始pH 6.1，在37℃条件下发酵7 d，发酵产物腐植酸含量为19.58%，较优化前腐植酸含量提高了38.3%。

关键词：腐植酸;玉米秸秆;枯草芽孢杆菌;响应面法;副产物综合利用

中图分类号：S 816.6 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）10-0047-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2021.10.010

Optimization of Humic Acid Production from Corn Straw Fermented byBacillus Subtilis Based on Response Surface Methodology

CHEN Yong-qiang

（Fujian Main Station of Agricultural Product Processing and Promotion， Fuzhou， Fujian 350003， China）

Abstract： In order to explore the best conditions for humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis， the proportion of corn straw and bran， the additive amount of urea and the initial pH of culture medium were taken as the experimental factors， and the content of humic acid was taken as the index. The factor levels were selected according to the results of single factor experiment， and the method of Box-Benhnken experimental design was used to study the interaction of various factors and their effects on humic acid， thus to obtain the quadratic polynomial regression model. The results showed that the optimal conditions of humic acid production from corn straw fermented by Bacillus subtilis were as follows： the proportion of corn straw and bran was 0.95∶1， the additive amount of urea was 0.81%， and the initial pH of culture medium was 6.1. After 7 days of fermentation at 37℃， the humic acid content of the fermentation products was 19.58%， which was 38.3% higher than that before the optimization.

Key words： Humic acid; Corn straw; Bacillus subtilis; Response surface methodology; Comprehensive utilization of by-products

玉米是我國重要粮食作物，每年产生大量玉米秸秆，如何提高这一农业废弃物的综合利用水平，减少环境污染和资源浪费，实现变废为宝、化害为利，具有非常重要的意义[1-3]。利用农业废弃物生产生物腐植酸是农业资源化和功能化的一个重要渠道，生物腐植酸活性比天然腐植酸高，作为一种生长调节剂，在种养殖等领域具有广泛用途[4-9]。当前生物腐植酸的发酵方法仍以人工堆建自然发酵为主，存在产量低、产品质量不稳定等问题[10-12]。本研究对前期筛选获得的具有腐植酸发酵能力的枯草芽孢杆菌进行发酵条件研究，以期为玉米秸秆的综合利用探索渠道，为利用玉米秸秆生产腐植酸提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 原料与菌株

玉米秸秆、麸皮采自龙海市白水镇，玉米秸秆烘干粉碎备用。

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis从市售有机肥中筛选获得。

1.2 试剂与培养基

菌种活化培养基与种子液培养基 [13]：牛肉膏 3 g·L-1，NaCl 5 g·L-1，蛋白胨 10 g·L-1，琼脂15 g·L-1，pH 7.0～7.2，121℃蒸汽灭菌20 min。种子液培养基不添加琼脂。

基础发酵培育基：玉米秸秆粉与麸皮重量1∶1，加水搅拌均匀，水分含量控制在75%左右，pH自然，121℃灭菌20 min。

试剂：重铬酸钾、硫酸亚铁铵、邻菲罗啉、浓硫酸、氢氧化钠均为分析纯。

1.3 主要仪器

BHC1300型超净工作台（苏静集团安泰公司），LRH型生化培养箱（上海一恒科技有限公司），THZ2气浴式恒温摇床（智城分析仪器制造有限公司），U2910型分光光度计（日本HITACHI公司），FZ102型植物粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）。

1.4 试验方法

1.4.1 种子液制备 将菌种从斜面转接到活化平板，37℃条件下生化培养箱培养24 h，然后转接3环菌种到含100 mL种子培养基的 250 mL锥形瓶中，37℃、200 r·min-1摇床培养24 h，取培养液与灭菌生理盐水混合，调节菌种液OD600在（1.0±0.1）作为发酵种子液。

1.4.2 发酵条件 500 mL锥形瓶装发酵培养基100 g，接种5 mL种子液，混合均匀，37℃条件下生化培养箱发酵7 d，其间每隔2 d搅拌1次。本试验内容均在此条件下发酵。

1.4.3 单因素试验 （1）玉米秸秆与麸皮配比研究。调整基础培养基玉米秸秆与麸皮比例，两者重量比分别2∶1、1.5∶1、1∶1、1∶1.5、1∶2，每个试验做3个平行，进行发酵产腐植酸研究，探索较优主要发酵原料配比。（2）尿素添加量研究。在前期无机氮对发酵产腐植酸影响的研究中发现添加尿素有较好的促进作用，因此在基础发酵培养中，以100 g玉米秸秆与麸皮基准，分别添加0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%尿素，每个试验做3个平行，探讨不同尿素添加量对发酵产腐殖酸的影响。（3）培养基初始pH研究。调节基础发酵培养基初始pH分别为4、4.5、5、5.5、6，每个试验做3个平行，探讨不同初始pH对发酵产腐殖酸的影响。

1.4.4 响应面试验设计 在单因素试验基础上，选取玉米秸秆与麸皮添加质量比（X1）、尿素添加量（X2）、培养基初始pH（X3）3个试验因素的较优区域，以腐植酸含量为响应值，使用Designer-Expert 8.0.6 Trial软件，进行三因素三水平Box-Benhnken Design（BBD）中心组合试验设计[14]（试验因素水平和编码见表1），通过回归分析优化枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸条件。

1.4.5 测定方法 采用重铬酸钾氧化法[15]测定发酵产物的腐植酸含量，以质量分数计，数值以%表示。试验样品发酵后60℃烘干2 h，经粉碎过筛后作为测定样品;未接种的培养基同样处理后作为空白样品;结果计算不再扣除氯離子含量。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 玉米秸秆与麸皮配比对产腐植酸的影响 由图1可知，发酵产物腐植酸含量随着玉米秸秆与麸皮添加量比值的降低，呈先快速增加后缓慢下降的变化趋势。在玉米秸秆与麸皮添加量比值为1∶1时，发酵产物腐植酸含量最高，为14.16%。

2.1.2 尿素添加量对产腐植酸的影响 由图2可知，发酵产物腐殖酸含量随着尿素添加量的增加，呈量先增后减的变化趋势。当尿素添加量为0.75%时，发酵产物腐殖酸含量最高，为18.15%。表明添加适量的尿素对枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸有促进作用，当添加量较大时起抑制作用，试验中尿素添加量为1.5%时，发酵产物腐植酸含量为13.51%，比最高值下降了25.61%。

2.1.3 培养基初始pH对产腐植酸的影响 从图3可知，发酵产物腐殖酸含量随着培养基初始pH值的升高，呈先升后降的变化趋势，在培养基初始pH值为6时发酵产物腐植酸含量最高，为15.39%。表明，该枯草芽孢杆菌比较适合在弱碱性条件下发酵玉米秸秆产腐植酸，过酸环境下产腐植酸能力受到抑制。

2.2 响应面试验结果及分析

2.2.1 拟合方程和方差分析 BBD试验设计及结果见表2。应用Design-Expert 软件对试验结果进行方差分析（表3），拟合多项式回归模型并作真实响应面拟合图。方差分析结果表明：模型P<0.000 1，说明模型极显著;失拟项P=0.288 0>0.05，说明模型拟合程度好，可以用该模型进行分析和预测。拟合腐植酸含量（Y）的多项式回归方程为：

Y=19.30-1.08X1+0.37X2+0.32X3-0.028X1X2+0.005X1X3-0.075X2X3-1.63X12-0.75X22-0.71X32

一次项X1（玉米秸秆与麸皮比重）、X2（尿素添加量）、X3（发酵初始pH）对发酵产腐植酸的影响均为极显著（P<0.000 1），二次项X12、X22、X32对发酵产腐植酸的影响均极显著（P<0.000 1），交互项中X2X3对发酵产腐植酸的影响显著（P<0.01）、其他两个交互项对发酵产腐植酸的影响不显著。

2.2.2 因素交互作用分析 由图4可知，随着尿素添加量的增加和培养基pH的提高，发酵产物腐植酸含量呈先升高后下降的变化趋势，表明在某一尿素添加量和某一培养基初始pH值条件下，发酵产物腐植酸含量具有极大值。

图4 尿素添加量和培养基初始pH对发酵的影响

Fig.4 Effects of the additive amount of urea and the initial pH of culture medium on fermentation

2.2.3 响应面优化发酵条件及验证 通过软件对回归模型求极值并将标准变量转换为实际变量，获得枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸的最佳条件为：玉米秸秆与麸皮添加量比值为0.95∶1，尿素添加量为0.81%，培养基初始pH为6.1，发酵产物腐植酸含量预测值为19.55%。在该发酵条件下，经5次重复验证试验，测得发酵产物腐植酸含量均值为19.58%，与预测值基本相符，说明该模型可以很好地预测实际发酵情况。

3 结论与讨论

可以利用枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸，提高玉米秸秆综合利用价值，减少农业废弃物带来环境污染和资源浪费。单因素试验表明：玉米秸秆与麸皮添加量比值、尿素添加量、培养基初始pH的变化，均会影响枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸的能力。随着麸皮添加量的增加腐植酸含量先升后降，这可能是玉米秸稈以碳源物质为主，而麸皮含有更为丰富的蛋白质、矿物质、维生素等营养物质，添加适量的麸皮可以促进菌体生长代谢产腐植酸，但麸皮添加量较大时菌体以扩大生物量为主，腐植酸产量反而下降;随着尿素添加量的增加腐植酸含量先升后降，这可能是尿素作为基础培育基的补充氮源被菌体利用，添加适量的尿素促进了菌体生长代谢从而增加了腐植酸产能，但添加量过大时尿素对菌体形成毒害作用，抑制了菌体的生长代谢;随着培养基初始pH的提升腐植酸含量先升后降，这可能是该菌较适生长环境为弱碱性，当培养基过酸或过碱时，菌体细胞膜通透性、膜内酶结构和功能受到影响，抑制了菌体对营养基质的利用和代谢产物的合成与积累。

通过响应曲面法进行试验设计和分析，结果表明：玉米秸秆与麸皮添加量比值、尿素添加量、培养基初始pH对发酵产物腐植酸含量的影响极显著，尿素添加量与培养基初始pH的交互作用对发酵产物腐植酸含量的影响显著;多项式回归模型拟合程度高，可以用来优化枯草芽孢杆菌发酵玉米秸秆产腐植酸的最佳条件、预测发酵产物腐植酸含量;优化获得最佳发酵条件为玉米秸秆与麸皮添加量比值0.95∶1、尿素添加量0.81%、培养基初始pH 6.1，经验证试验测定发酵产物腐植酸含量为19.58%，较优化前腐植酸含量提高了38.3%。

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（责任编辑：柯文辉）

收稿日期：2021-09-09

作者简介：陈勇强，男，1986年生，工程师，主要从事农产品加工推广。