油 畅, 崔 骏, 李 强, 刘娇娴, 郑明霞, 杨 超, 何小松,, 张茉莉, 涂 响*

1.中国环境科学研究院, 国家环境保护饮用水水源地保护重点实验室, 北京 100012 2.中国环境科学研究院, 国家环境保护地下水模拟与控制重点实验室, 北京 100012 3.首都经济贸易大学城市经济与公共管理学院, 北京 100070

随着我国经济的快速发展、城市人口数量的急剧增加以及垃圾分类的有效推进，城市生活垃圾中易腐有机组分含量逐年增加，渗滤液和恶臭污染日益加剧[1]. 堆肥是一种生物转化技术，可以实现易腐垃圾、污泥与粪便等有机废物的生物转化[2-3]，它不仅可高温消除人类病原体、降低环境风险，还可形成腐殖酸类物质，作为有机肥施用[4-5].

堆肥腐殖酸具有多种环境功能，包括改变微量元素的迁移、固定及淋溶，间接激活或抑制土壤酶活性，保护和贮存诸多营养元素，在保持土壤结构稳定和提高土壤持水性方面发挥着重要作用[6]. 此外，堆肥腐殖酸还可加速微生物对矿物、有机污染物的还原转化，被誉为自然环境中理想的“电子穿梭体”[7-9]，其电子传递的主要机理源于腐殖酸中醌-酚结构的氧化与还原过程[10]. 有研究[11]表明，腐殖酸中含氮和含硫基团也具有电子转移能力. 因此，探究堆肥过程中所形成腐殖酸的组成特征、形成规律及氧化还原特征，对于堆肥资源化利用和利用堆肥修复土壤污染意义重大.

有学者基于土壤腐殖质组成，推测腐殖酸主要由氨基酸和木质纤维素形成[12-14]，但堆肥过程中氨基酸组成及其与木质纤维素形成腐殖酸的特征，以及堆肥曝气和厌氧过程中腐殖酸在电子得失过程中被还原和氧化的机理均尚不清楚，因此无法评判氧化还原过程对堆肥腐殖酸形成的影响. 基于此，该研究通过调查堆肥腐殖酸中氨基酸组成及其含量变化，分析堆肥过程与腐殖酸形成相关多种氮、碳结构的演化规律，揭示堆肥腐殖酸的氧化还原活性及得失电子对腐殖酸组成的影响，以期为改善堆肥产品品质以及提升其肥效和改善其环境修复性能提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 堆肥材料

样品采集于北京市某生活垃圾堆肥厂. 该堆肥厂首先对生活垃圾进行筛分，分拣出塑料、纸张、金属等不可堆肥物质，将剩余残渣进行生物发酵. 堆肥分为一次发酵和二次发酵：一次发酵21 d，每2 d翻堆一次进行供氧；二次发酵30 d，每7 d翻堆一次，堆肥持续51 d. 分别于第0、7、14、21、28、51天进行取样，每个样品采集2份，每份不少于500 g，随后将其进行混合均匀，剔除大块物质后，过筛，筛下物用于提取腐殖酸.

1.2 腐殖酸测定

将250 g堆肥样品经过磨碎处理后，用100 mL 0.05 mol/L NaOH溶液在氮气气氛下提取腐殖酸，摇12 h，10 000 r/min下离心30 min，将50 mL 0.05 mol/L HCl、25 mL 0.15 mol/L HF与腐殖酸混合，去除硅酸盐，将样品分解透析，净化腐殖酸[15]. 运用Folin-Lowry法测定腐殖酸含量，将8 g NaOH与40 g Na2CO3溶解于2 L去离子水中，取0.8 mL该溶液与2 mL净化后的腐殖酸溶液混合，常温下静置20 min，加入Folin-酚试剂，混合后静置30 min，使用分光光度计(HitachiF-7000，日立集团，Japan)测量其吸光度值.

1.3 氨基酸测定

称取氨基酸标准样品溶于0.1 mol/L HCl水溶液中，配置成10 mmol/L的单标溶液，取适量单标溶液混合配制成浓度为0.6 mmol/L的混标溶液，备用. 将氨基酸化合物衍生处理后，采用高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸含量. 选用LiChrospher 100 RP-18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相A为25 mmol/L醋酸钠水溶液(pH=5.8)；四氢呋喃与水的体积比为95∶5，超声15 min，过0.45 μm滤膜；流动相B为甲醇(色谱级)；流速为1.0 mL/min；λEm=340 nm，λEx=450 nm；进样量为10 μL. 分梯度洗脱.

1.4 XPS、FTIR、NMR与同步荧光的测定

使用X射线光电子能谱仪(K-Alpha，Thermo Scientific，USA)测定腐殖酸中氮形态的分布情况，以C 1s(284.6 eV)为定标标准[16].

使用傅里叶变换红外分光光度计(FT-IR，Nicolet6700/8700，Thermo Scientific，USA)测定500～4 000 cm-1范围内堆肥腐殖酸官能团的组成[17-20].

采用BrukermodelAV-300光谱仪(Bruker，Billerica，MA，USA)，直接测量堆肥腐殖酸的固态CP/MAS13C NMR谱[21]. 此外，将腐殖酸样品溶解后，采用荧光分光度计(HitachiF-7000，日立集团，Japan)，在270～550 nm范围内测定腐殖酸的同步荧光光谱，测试波长差为30 nm，扫描速度240 nm/min[22].

1.5 电化学测定

使用电化学工作站(CHI660D，上海晨华有限公司)以石墨板、Pt和Ag/AgCl分别为工作电极、对电极和参比电极，电解液为饱和二甲基亚砜(DMSO)溶液(pH=7.0)，测定线性伏安曲线(LSV). 在氮饱和磷酸盐缓冲溶液(pH=7.0)中，测量腐殖酸的电子供给能力(EDC)和电子接受能力(EAC)，扫描电压范围为-1.5～1.0 V，扫描速率设定为10 mV/s，在氮饱和磷酸盐缓冲溶液的腐殖酸样品中，通过正电流，电压为0.5 V，然后测定氧化后样品的同步荧光光谱；在氮饱和磷酸盐缓冲溶液的腐殖酸样品中，通过负电流，电压为0.6 V，然后测定还原后样品的同步荧光光谱；在氮饱和磷酸盐缓冲溶液的腐殖酸样品中，先通过正电流，电压为0.5 V，随后通过负电流，电压为0.6 V，再通过正电流，驯化循环反复多次，随后测定经过氧化和还原处理的腐殖酸溶液的同步荧光光谱[23].

2 结果与讨论

2.1 堆肥过程腐殖酸中有机氮转化特征

从生活垃圾堆肥提取的腐殖酸共检测出15种氨基酸(见表1)，将其按电荷类分为酸性氨基酸(Asp和Glu)、碱性氨基酸(Lys、His、Arg)、中性氨基酸(Val、Ala、Ile、Gly、Leu)、带羟基氨基酸(Ser、Thr)、芳香基氨基酸(Tyr、Phe)及甲硫氨基酸(Met). 在氨基酸含量大于100 mg/g的堆肥样品中，酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高，占氨基酸总含量的比值为25.8%；在氨基酸含量为50～100 mg/g的堆肥样品中，碱性氨基酸(His和Lys)含量最高，占氨基酸总含量的11.3%. 在氨基酸含量小于50 mg/g的堆肥样品中，中性氨基酸(Gly、Ile、Val)含量最高，占氨基酸总含量的9.23%，最少的是Ser，平均含量只有3.78 mg/g.

表1 堆肥样品中氨基酸含量描述性分析

随堆肥发酵的进行，腐殖酸中氨基酸含量总体呈下降趋势，但在部分时段出现上升. 堆肥初期(0～7 d)，各类型氨基酸含量均呈增加趋势，其中Arg(70.1%)、His(43.3%)和Val(38.5%)的增幅较高；Met(0.78%)和Gly(7.02%)的增幅较低. 在堆肥中期(7～14 d)，氨基酸含量呈两极分化趋势，Ser(-100%)的降幅最高，Met(100%)、Val(69.3%)、Phe(55.6%)的增幅较高. 在堆肥后期(14～51 d)，各类氨基酸含量均呈降解趋势，Ile、Gly的降解速率始终较高，Ser的降解速率随堆肥时间的增加而递增，Val、Met、Phe的降解速率则递减. 堆肥发酵过程中氨基酸含量总体呈下降趋势，表明与腐殖酸中其他结构相比，氨基酸生物活性较高，易被生物降解和利用.

为进一步证实上述结果，该研究测定了腐殖酸的N、C含量，计算了氨基酸N、C含量在腐殖酸N、C含量中的占比，结果如图1所示. 堆肥初期(0～14 d)，腐殖酸中将近75%的N为氨基酸态N，随堆肥发酵的进行，氨基酸迅速降解，到堆肥末期50%左右的N为氨基酸态N. 与之类似，堆肥起始氨基酸C含量/腐殖酸C含量小于20%，随堆肥发酵的进行，氨基酸C含量/腐殖酸C含量增加，高温期可在25%左右，但随后氨基酸迅速降解，氨基酸C含量/腐殖酸C含量又降至不足20%.

图1 堆肥过程中氨基酸和腐殖酸中 N、C含量的变化Fig.1 Changes in N and C contents in amino acids and humic acids during composting

为进一步探讨堆肥过程中主要是哪些形态的氮发生降解，使用XPS对堆肥氨基酸中氮形态进行甄别，共监测到吡啶(N-6)、吡咯(N-5)、质子化吡啶(N-Q)及氮氧化合物形态的氮(N-X)(见图2). 堆肥起始时(第0天)，样品中检测到N-5(399.84 eV)和N-X(407.3 eV)，二者的积分面积在不同形态氮的总积分面积中占比分别为74.6%和25.4%；堆肥第7天后检测到N-6特征峰，其面积占比为47.15%，而N-5的面积占比为51.66%；堆肥第14天后出现N-Q，其面积占比为54.68%；堆肥第21天，N-6、N-5、N-Q、N-X的含量较为均衡，面积占比分别为24.48%、29.84%、24.13%、21.55%；堆肥第28天及以后，除N-X含量较低外，其余形态氮的含量均保持稳定. 以上结果表明，吡咯是堆肥腐殖酸中氮的主要存在形态，而质子化吡啶在堆肥第14天才产生，表明大量的有机氮(包括吡啶和吡咯)被氧化，开始形成质子化吡啶[24-30].

注：N-6表示吡啶，N-5表示吡咯，N-Q表示质子化吡啶，N-X表示氮氧化合物.图2 氮元素形态变化的XPS谱图Fig.2 XPS spectrum of the morphological changes of N element

2.2 堆肥过程腐殖酸中碳的形态转化特征

2.2.1堆肥腐殖酸的含碳官能团变化特征

图3 堆肥腐殖酸的FTIR谱图Fig.3 FTIR spectrum of humic acid in compost

2.2.2堆肥腐殖酸中碳骨架的变化特征

不同堆肥阶段腐殖酸的核磁共振(13C NMR)谱分析结果(见图4)显示，在14、23、30、33、38、55、130、182 ppm处出现了多个峰，14和23 ppm处分别对应于CCH和CCH2，55 ppm处的峰可能为木质素单元芳香环上的甲基取代物，130 ppm处的峰归因于芳香碳和不饱和碳，182 ppm处的峰归因于COO-[40]. 堆肥0～21 d，13C NMR谱无显著差异，堆肥21～51 d内100～175 ppm处的峰呈小幅增加，表明随发酵的进行，木质纤维素降解形成的芳香官能团和羧基不断增强. CCH、CCH2的含量在堆肥前最高，之后逐渐减少，结合之前的羧基、羰基变化特征，表明堆肥过程腐殖酸中大量脂肪官能团被降解和氧化，形成羧基、羰基等极性官能团.

图4 堆肥腐殖酸的NMR谱图Fig.4 NMR spectra of humic acid in compost

有机质的13C NMR光谱带可分为5个化学区域：脂肪族碳(0～50 ppm)、甲氧基碳(50～60 ppm)、多糖碳(60～100 ppm)、芳香结构碳(100～160 ppm)及羧基/羰基碳(160～200 ppm)[41]. 堆肥过程中腐殖酸NMR峰的面积占比如表2所示. 脂肪族碳(0～50 ppm)和甲氧基碳(50～60 ppm)的强度最强，在积分总面积中的占比为49.7%～78.8%. 其中，堆肥第0天脂肪族碳含量最高，随堆肥时间的延长其含量逐渐下降，显示脂肪碳在堆肥过程中快速被降解. 芳香族碳(100～160 ppm)的面积占比为10.0%～23.2%，随堆肥发酵的进行，其含量逐渐增加，至第28天达到最高，显示大量木质纤维素在堆肥过程中被降解和转化形成腐殖酸. 羧基/羰基碳(160～200 ppm)的面积占比为10.5%～17.1%，随堆肥时间的延长，羧基/羰基碳的峰面积占比增加，显示堆肥发酵过程中羧基/羰基碳含量增加.

表2 腐殖酸NMR峰的面积占比

2.3 腐殖酸的电化学氧化还原活性分析

为探究堆肥腐殖酸的氧化还原活性，利用电化学技术进行腐殖酸伏安曲线扫描，结果如图5和表3所示. 在负向扫描中，电子从电极转移到与腐殖酸上的氧化还原活性基团，形成负电流. 在电极界面发生还原反应，消耗还原材料，导致阴极电流较少，从而在LSV图中形成还原峰. 在正向扫描中，电子从腐殖酸转移到电极，形成氧化峰. 峰值电位之差(ΔEp)>0.059 V，IpA/IpC绝对值的最大值接近1，属于准可逆反应. 随着堆肥时间的延长，正向扫描和负向扫描的LSV峰值强度及峰值电位之差均呈增加趋势，显示随着堆肥发酵的进行，腐殖酸的氧化和还原能力逐渐增强，即堆肥发酵增加了腐殖酸中具有电子转移的官能团含量.

图5 DMSO溶液LSV线性扫描伏安曲线Fig.5 LSV linear sweep voltammetry curve of phosphate buffer solution

表3 电化学参数

腐殖酸的电子转移能力(ETC)对土壤环境中污染物去除相关的氧化还原反应有极为重要的影响. 在电化学工作站上，正电压扫描模式下加入腐殖酸后电极材料会失去电子，形成氧化峰，获得经氧化后的腐殖酸溶液；负电压扫描模式加入腐殖酸后电极材料会得到电子，通过还原反应形成还原峰，获得经还原后的腐殖酸溶液. 在正电压—负电压—正电压—负电压扫描模式下，溶液中同步进行着腐殖酸的氧化还原反应，最终获得腐殖酸反复得失电子后的溶液. 测定腐殖酸经氧化、还原和反复氧化-还原后溶液的同步荧光光谱，分析氧化还原反应对腐殖酸组成的影响，结果如图6所示.

图6 腐殖酸的同步荧光光谱Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of humic acid

对上述经氧化、还原和反复氧化-还原反应得到的腐殖酸，采用同步荧光光谱进行结构和组成分析. 6个腐殖酸样品在280 nm处均有一个强荧光峰，由芳香性氨基酸引起，即类蛋白物质；340、370、480 nm附近出现的特征荧光峰对应类富里酸和类胡敏酸[42]. 随堆肥时间的延长，类蛋白物质荧光强度存在一定程度的降低，而腐殖质类物质荧光强度逐渐增加. 荧光强度也能反映腐殖酸的氧化还原能力，腐殖酸的荧光猝灭幅度与其电子供给能力呈正相关；荧光增强程度与其电子接受能力成正比.

图6中“循环”表示反复氧化-还原反应后的样品. 堆肥第0天，未处理样品(原始样品)所含类蛋白物质的荧光强度最高，经过氧化、还原反应后类蛋白物质呈降解趋势，不同反应的降解强度表现为氧化>还原>循环，显示氧化反应对腐殖酸的降解能力最强，还原反应其次，反复氧化-还原对腐殖酸降解的影响最小；与第0天相比，堆肥第7天原始样品中类蛋白物质大量被降解，类腐殖酸物质逐渐生成，但在单一的氧化反应与还原反应作用下，大分子类富里酸和胡敏酸物质降解形成了少量类蛋白物质. 与堆肥第7天相比，第14天原始样品中类蛋白与类腐殖酸物质含量又有小幅增加，其中氧化后类蛋白物质的降解幅度最大，还原后也有少量降解，在氧化与还原反复作用下呈现一定量的生成趋势. 类腐殖酸物质在单一的氧化与还原反应后均呈现一定量的降解，但在氧化、还原反复作用下呈激增趋势，显示在还原过程中，部分小分子类蛋白物质可能结合形成了类腐殖酸物质.

堆肥第21天，原始样品中类蛋白物质含量的变化较小，类腐殖酸物质有少量生成，其中，类蛋白物质的降解强度表现为氧化>还原，而氧化、还原的反复进行下类蛋白物质含量不断增加，类腐殖酸在氧化与还原反应后均有不同程度的降解，降解强度表现为氧化>还原>循环；堆肥第28天与第51天，类蛋白物质的含量在氧化还原反应后均有增加，增加强度均表现为循环>还原>氧化，类腐殖酸物质均呈现降解趋势，显示氧化和还原过程(即电子转移过程)会促进腐殖酸降解，形成小分子有机物.

在堆肥第7、21、28、51天的样品中，经过氧化和还原电流后，腐殖酸的最大荧光峰发生蓝移，从长波段向短波段移动，意味着氧化和还原过程都可能造成腐殖酸物质分子结构的破坏. 腐殖酸物质属于含苯环小分子有机物通过疏水作用、氢键和范德华等结合在一起的大分子有机物，氧化还原过程中这些弱结合力(即特征官能团)被破坏，腐殖酸发生解聚和部分降解，形成小分子有机物，导致类蛋白物质含量增加.

以上结果也表明，采用堆肥腐殖酸修复污染土壤，很多官能团只能利用一次，经电子转移后，其本身结构会发生破坏，不能再发生作用，故需要适当再补充活性腐殖酸，以提升其土壤修复和改良效果.

3 结论

a) 堆肥腐殖酸共检测出15种氨基酸，其中，酸性氨基酸(Asp和Glu)含量最高，在氨基酸总含量中的占比为25.8%；其次是碱性氨基酸(His和Lys)的含量，在氨基酸总含量中的占比为11.3%；再次是中性氨基酸(Gly、Ile、Val)的含量，在氨基酸总含量中的占比为9.23%；Ser含量最低，平均含量只有3.78 mg/g. 与腐殖酸中其他物质相比，氨基酸生物活性高，易被生物降解和利用，随着堆肥发酵过程的进行，氨基酸含量总体呈下降趋势.

b) 堆肥初期(0～14 d)，腐殖酸中75%左右的氮为氨基酸态氮，随堆肥发酵的进行，氨基酸迅速降解，到堆肥末期50%左右的氮为氨基酸态氮. 氨基酸中碳含量占腐殖酸中碳含量的比例不到25%，并随发酵的进行而不断降解，氨基酸中碳含量占腐殖酸中碳含量的比例最终不足20%. 吡咯是堆肥腐殖酸中氮的主要存在形态，而质子化吡啶在堆肥第14天才产生，大量的有机氮(包括吡啶和吡咯)在堆肥过程中被氧化和降解.

c) 随着发酵的进行，木质纤维素降解形成腐殖酸，并且腐殖酸中大量脂肪族官能团被降解，羧酸类、醛、酮及苯环官能团增加，提升了腐殖酸中氧化还原活性官能团含量，导致腐殖酸的氧化和还原性能增加. 但腐殖酸通过得失电子，进行氧化和还原反应会造成部分氧化还原活性官能团降解，大分子腐殖酸被降解和转化为小分子有机物. 因此，利用腐殖酸环境修复过程，需要适当补充活性腐殖酸.