张广瑞, 胡利强, 李海松

1.郑州大学化工学院, 河南 郑州 450001 2.新乡学院化学与材料工程学院, 河南 新乡 453003 3.郑州大学生态与环境学院, 河南 郑州 450001

高浓度NH4+-N废水主要来源于焦化废水、合成氨废水、垃圾渗滤液等[1-3]，该类废水具有成分复杂、可生化性差的特点，使得传统脱氮工艺处理效果不佳[4]. 近年来，短程硝化工艺应用广泛，该工艺具有节省25%曝气量和30%反应时间的优势[5]，且能与反硝化[6-7]和厌氧氨氧化[8-9]工艺耦合实现高效经济脱氮. 据报道，高浓度NH4+-N可产生FA(游离氨)对NOB(亚硝酸盐氧化菌)产生强烈抑制作用，抑制浓度范围为0.1～1.0 mg/L，而FA对AOB(氨氧化菌)的抑制浓度范围为10～150 mg/L[10]. FNA(游离亚硝酸)对AOB和NOB也有抑制作用，抑制浓度范围分别为0.22～2.80和0.01～0.22 mg/L[11-12]. 由于AOB和NOB对FA和FNA的敏感性和耐受性具有较大差异，控制FA和FNA浓度成为实现NO2--N积累的重要条件之一[13-14].

在已有研究中，国内外研究者在CSTR(连续搅拌反应器)、SBR(序批式反应器)、PFR(推流式反应器)等传统活性污泥工艺中通过FA与FNA对NOB的抑制作用实现了短程硝化过程[15-16]，但存在污泥流失、系统运行不稳定等问题[17]. MBR(膜生物反应器)将膜分离单元与生物处理单元相结合，以膜组件取代传统生物处理技术末端的二沉池，可实现污泥的高效截留[18]，有利于生长速率缓慢的AOB富集，从而缩短短程硝化的启动时间. 因此，MBR在处理高浓度NH4+-N废水并实现短程硝化方面有极大的潜力[19]. 李强等[20]研究表明，采用实验室规模A/O-MBR 工艺处理模拟高浓度NH4+-N农药生产废水，MBR运行60 d后实现了稳定的短程硝化，NO2--N平均积累率为94.50%. 王秀杰等[21]研究表明，在实验室规模MBR中处理晚期垃圾渗滤液，在短程硝化稳定运行阶段，NO2--N积累率达到98.22%.

目前，采用MBR处理高浓度NH4+-N废水的研究主要集中于实验室规模，且通常采用模拟废水，而中试规模MBR处理实际高浓度NH4+-N废水的研究鲜见报道. 该试验旨在通过中试MBR处理实际高浓度NH4+-N废水，通过控制系统内FA与FNA浓度实现稳定的短程硝化，同时考察系统中微生物群落结构变化，确定优势菌群并预测功能基因，为实现可控化短程硝化实际应用提供理论依据与指导.

1 材料与方法

1.1 试验装置

如图1所示，中试MBR主要由配水池、反应池和反洗水池组成. 反应池有效容积为6.75 m3，内置聚偏氟乙烯中空纤维膜，膜面积70 m2，膜孔径0.05 μm，膜通量10～20 L/(m2·h). 膜组件采用间歇抽吸式出水，抽吸泵运行8 min，停止2 min，当抽吸泵累计运行60 min后开启反洗泵反冲洗2 min. 膜组件底部设有曝气盘，通过空气泵进行曝气. 反应器内设有pH计和溶氧仪探头，对反应器内pH和DO(溶解氧)浓度进行实时监控. 反应器的运行通过PLC(可编程逻辑控制器)来控制.

注： 1—配水池；2—进水泵；3—反应池；4—膜组件；5—曝气盘； 6—空气泵；7—pH计；8—溶氧仪；9—抽吸泵； 10—反洗泵；11—反洗水池.图1 中试MBR试验装置Fig.1 Diagram of pilot-scale MBR

1.2 试验用水与反应器接种

试验根据进水水质不同分为2个阶段，第1阶段(1～30 d)为模拟工业废水，第2阶段(31～50 d)为河南省平顶山市某化工厂实际工业废水，进水水质情况见表1. 试验过程中向实际废水中添加NaHCO3以维持系统碱度充足. 第1和第2阶段进水流量为4.27～10.22 m3/d，反应池内DO浓度通过PLC控制在1～2 mg/L. 接种污泥来源于该化工厂污水处理站A/O工艺好氧池，接种时泥水混合液悬浮固体浓度(MLSS)为 4 790 mg/L. 接种污泥驯化过程中进水为模拟工业废水，进水流量为1.49～2.98 m3/d，驯化5 d后反应器进入第1阶段. 两个阶段运行过程中均未进行排泥.

表1 进水水质情况

1.3 分析与测定

试验测定指标包括NH4+-N、NO3--N、NO2--N、DO和pH. NH4+-N浓度采用纳氏试剂光度法测定；NO3--N浓度采用紫外分光光度法测定；NO2--N浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法测定[22]；DO浓度和pH利用实时在线监测系统进行测定.

将反应器运行第0天(即接种污泥)和第50天的活性污泥样本送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行16S rRNA基因高通量测序分析. 利用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit试剂盒提取DNA，PCR所用的引物为Miseq测序平台的V3～V4通用引物，341F引物为CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode)CCTACGGGNGGCWGCAG，805R引物为GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTAC HVGGGTATCTAATCC，具体操作方法参见文献[23].

1.4 相关计算：

NAR、FA和FNA的计算方法分别如式(1)[24]、式(2)[10]、式(3)[10]所示：

(1)

(2)

(3)

式中：NAR为亚硝酸盐积累率，%；cNO2--N为出水NO2--N浓度，mg/L；cNO3--N为出水NO3--N浓度，mg/L；FA为游离氨浓度，mg/L；cNH4+-N为出水NH4+-N浓度，mg/L；T为水温，℃；FNA为游离亚硝酸盐氮浓度，mg/L.

2 结果与讨论

2.1 中试MBR对NH4+-N的去除效果

中试MBR进出水中氮素浓度及pH变化如图2所示. 在反应器运行第1阶段，进水NH4+-N浓度逐渐提高，浓度在167～762 mg/L之间波动，此时反应池内DO浓度低于2 mg/L. 该阶段出水NH4+-N浓度存在波动，但在稳定运行情况下NH4+-N去除率大于96%. 从图2可以明显看出，出水NO2--N浓度随反应器运行呈逐渐升高趋势，浓度由初始的1 mg/L最终达到380 mg/L左右. 而出水NO3--N浓度则呈下降趋势，最终稳定在110 mg/L左右. 该阶段试验结果表明，随着NH4+-N容积负荷逐步提升，系统逐渐由完全硝化转变成短程硝化，最终实现NO2--N的稳定积累.

图2 中试MBR进出水氮素浓度及pH变化Fig.2 The variations of nitrogen concentration and pH in influent and effluent of pilot-scale MBR

第2阶段将中试MBR进水改为实际工业废水，进水NH4+-N浓度为389～1 089 mg/L，NO3--N浓度、NO2--N浓度和pH与第1阶段接近. 从图2也可以看出，除第33天外，该阶段出水NH4+-N浓度稳定在50 mg/L以下，去除率在93%以上，NO2--N浓度为346～552 mg/L，NO3--N浓度稳定在120 mg/L左右. 该阶段试验结果表明，活性污泥经过第1阶段模拟高浓度NH4+-N废水驯化后，能适应相同NH4+-N容积负荷的实际工业废水，并且能维持NO2--N的稳定积累. 在中试MBR整个运行过程中，出水pH始终低于进水，稳定在7.3～8.0，表明反应器内始终进行着稳定的硝化反应.

2.2 FA与FNA对短程硝化的影响

在模拟工业废水作为进水的第1阶段，NH4+-N容积负荷逐渐从0.11 kg/(m3·d)提升至0.75 kg/(m3·d). 如图3所示，反应器运行前17 d，NAR小于50%，从第18天开始，NAR明显提高，最终在第1阶段运行结束时达到85%，相对应出水中的NO2--N浓度为384 mg/L. 李柏林等[25]建立SBR反应器，通过不断提高进水NH4+-N浓度实现出水NO2--N积累，系统运行30 d后NAR达到75.71%，NH4+-N去除率为80%. 当第2阶段进水由模拟工业废水调整为实际工业废水时，维持NH4+-N容积负荷为0.50～0.74 kg/(m3·d)，NAR依然可以维持在70%以上. 在整个MBR运行阶段，随着NH4+-N容积负荷的提高，反应器成功实现了短程硝化过程并获得了稳定的NO2--N积累，进水由模拟废水向实际工业废水的转变并没有对NAR产生较大影响，表明该中试MBR适应能力较强.

图3 NAR及FA、FNA浓度随运行时间的变化Fig.3 The variations of NAR, FA and FNA concentrations with running time

FA与FNA是硝化过程的基质，但FA与FNA浓度过高会影响AOB和NOB的生长及活性[26]. 研究表明，AOB比NOB具有更高的FA与FNA耐受性[14,27]，通过将FA与FNA的浓度控制在一定范围内能够实现NO2--N的积累. 由图3可知，前15 d反应器处于稳定运行时，FA浓度小于0.41 mg/L，FNA浓度小于0.011 mg/L，此时NAR低于20%，该运行期间全程硝化过程占主导. 从第16天开始，反应器内FA与FNA浓度升高，在第2阶段反应器处于稳定运行时，NH4+-N去除率为87.92%～97.18%，FA浓度变化范围为1.03～3.52 mg/L，FNA浓度变化范围为0.033～0.118 mg/L，FA与FNA浓度均在NOB抑制范围内，此时NAR为65.70%～80.24%，该运行期间短程硝化过程占主导. 值得注意的是，在反应器运行的第33天，进水NH4+-N浓度高达 1 089 mg/L，导致反应池内FA浓度从1.80 mg/L增至11.11 mg/L，NAR由74.80%提高至87.41%，但NH4+-N去除率从90.01%降至86.06%，表明提高进水NH4+-N浓度导致反应器内产生大量FA，FA对NOB产生的抑制作用促进了NO2--N的积累，同时FA浓度升至AOB抑制浓度下限(10 mg/L)，FA对AOB的抑制作用导致NH4+-N去除率下降. 第34天时，进水NH4+-N浓度恢复正常，同时NAR和NH4+-N去除率分别恢复至77.53%和93.03%，表明FA对AOB的短期抑制作用是可逆的，这与孙洪伟等[28]的研究结果一致. 因此在不同进水条件下，维持反应器内FA与FNA浓度在合适的范围内是实现稳定短程硝化过程的重要因素.

该研究采用中试MBR，通过控制反应器内FA与FNA浓度在NOB抑制范围内，成功实现短程硝化过程，为处理实际高浓度NH4+-N废水提供了理论指导与数据参考，具有推动短程硝化技术工程化应用的价值.

2.3 微生物群落分析

2.3.1生物多样性分析

采用16S rRNA基因高通量测序技术对中试MBR运行第0天和第50天的活性污泥样本进行测序，测序数据及α多样性指数如表2所示. 由表2可见：第0天和第50天的污泥样本序列数分别为 41 274 和 80 852，覆盖率为93%和96%，表明样本中大部分序列被检测出，测序质量较好；随着反应器的运行，Chao1指数从第0天的 61 625.01 降至第50天的 17 998.21，表明反应器内微生物群落丰度降低；Simpson指数从0.09增至0.11，表明微生物群落多样性降低. 反应器内微生物多样性与水质密切相关[29]，表明FA与FNA浓度升高是导致微生物群落丰度和多样性下降的主要原因.

表2 样本测序数据及α多样性指数

2.3.2菌群结构变化

MBR中试反应器中微生物群落结构组成(相对丰度大于1%)如图4所示. 从门水平分布结果来看，Proteobacteria和Bacteroidetes为反应器中的优势菌门，普遍存在于污水处理厂活性污泥系统中[30]. Proteobacteria相对丰度从第0天的68.91%降至第50天的27.92%，Bacteroidetes相对丰度从第0天的17.06%增至第50天的46.44%. 硝化细菌Nitrospirae的相对丰度从第0天的0.00%增至第50天的4.11%，表明高浓度NH4+-N废水有利于系统中硝化细菌的生长和富集. 此外，当反应器运行至第50天时，观察到Planctomycetes、Firmicutes、Chloroflexi、Gemmatimonadetes和Verrucomicrobia的相对丰度表现出不同程度的增加，表明进水条件的改变直接影响菌群结构组成.

图4 MBR中试反应器中微生物群落结构组成Fig.4 The composition of microbial community structure in MBR pilot reactor

从属水平分布结果来看，随着反应器运行微生物群落结构发生明显改变. 反应器内的优势菌群由第0天的Ohtaekwangia、Meiothermus、Hyphmicrobium、Thauera和Methyloversatilis转变为第50天的Nitrosomonas、Ohtaekwangia、Meiothermus、Nitrospira和Aridibacter.Nitrosomonas和Nitrospira分别为AOB和NOB的重要菌属，是参与硝化过程的两种重要微生物，其相对丰度和活性将决定系统内NH4+-N的去除效果[31].Nitrosomonas和Nitrospira的相对丰度分别由第0天的0.55%和0.00%增至7.99%和4.11%，成为反应器内的优势菌属. 第0天时反应器内FA和FNA浓度分别为0.01和0.000 mg/L，第50天时分别为0.50和0.099 mg/L，持续的底物供应保障了Nitrosomonas和Nitrospira的增长. 此外，在第50天的微生物样本中还检测到反硝化菌存在，如Meiothermus和Aridibacter[32-33]. 中试MBR运行过程中，或存在约10%的三氮之和损失率(数据未列出)，表明反应器具有一定的反硝化作用.Ohtaekwangia始终是反应器内的优势菌属，属于Bacteroidetes[34]，其在反应器内发挥的功能有待进一步研究.

2.3.3功能基因预测

采用KEGG代谢通路功能预测，对比了第0天和第50天污泥样本中主要功能基因种类，结果如图5所示. PICRUSt分析通过与数据库对比，将微生物功能和菌群结构变化情况及反应器运行性能变化联系起来[35-36]. 由图5(a)二级功能基因预测可知，氨基酸代谢(Amino Acid Metabolism)、膜运输(Membrane Transport)、碳水化合物代谢(Carbohydrate Metabolism)、复制和修复(Replication and Repair)、能量代谢(Energy Metabolism)、翻译(Translation)、辅助因子和微生物代谢(Metabolism of Cofactors and Vitamins)和细胞过程和信号(Cellular Processes and Signaling)功能基因的表达相对较高. 氨基酸代谢包括脱氨基作用、氨的代谢等，与MBR中氮类污染物的相互转化直接相关，为第0天污泥样本中的首要功能基因，相对丰度为11.11%，膜运输功能基因相对丰度为13.25%. 反应器运行中，底物的运输与传质影响着微生物的形成及群落变化，在第50天的污泥样本中，氨基酸代谢功能基因相对丰度保持稳定(10.84%)，而膜运输功能基因相对丰度则降至8.75%.

图5(b)为反应器中与氮氧化及还原相关功能基因相对丰度变化情况. 由图5(b)可见，Amo(氨单加氧酶)基因的相对丰度随反应器运行时间有明显增加趋势，第50天为7.42%，约是第0天的371倍.Amo是实现短程硝化过程的关键酶，参与NH4+-N向NO2--N转化的过程[37]，其功能基因相对丰度的增加进一步证明反应器内实现了短程硝化过程. 参与反硝化反应的Nap(硝酸盐还原酶)、Nor(一氧化氮还原酶)和Nir(亚硝酸盐还原酶)的基因相对丰度较低，结合反应器内三氮之和损失和反硝化菌相对丰度，证明反应器存在一定的反硝化功能.

图5 KEGG功能基因预测Fig.5 KEGG functional gene prediction

3 结论

a) 在中试MBR中通过将NH4+-N容积负荷从0.11 kg/(m3·d)提高至0.75 kg/(m3·d)，在第18天实现了全程硝化向短程硝化的转变. 维持FA和FNA浓度分别在1.03～3.52 mg/L和0.033～0.118 mg/L之间，NAR为65.70%～80.24%，同时NH4+-N去除率为87.92%～97.18%. 进水由模拟废水向实际工业废水的转变并没有对NAR产生较大影响，中试MBR具有较强适应能力.

b) 高通量测序结果表明，高浓度NH4+-N进水是导致微生物群落丰度和多样性下降的主要原因. Proteobacteria和Bacteroidetes是反应器中的优势菌门，通过控制反应器内FA和FNA浓度使硝化细菌Nitrosomonas得到富集，进而实现NO2--N的积累.

c) 反应器运行第50天时Amo功能基因相对丰度约是第0天的371倍，进一步验证了反应器内成功实现了短程硝化过程.