氨基酸衍生物的非水毛细管电泳分离研究

2021-12-20谢银凤石瑞卿

广州化工 2021年23期

谢银凤，石瑞卿，张辉

(1 山东省潍坊生态环境监测中心，山东潍坊 261041;2 北京华企动力信息技术有限公司，北京 100089)

氨基酸是构成蛋白质的基本单元，在生命有机体新陈代谢的过程中起着关键作用，研究其分离分析在食品科学、生物化学和临床医学等领域有着十分重要的意义[1-3]。大多数氨基酸本身没有天然的紫外或荧光吸收，为拓展其检测的技术手段，提高其分离选择性和分析灵敏度，经常需要对氨基酸进行柱前衍生。目前，氨基酸的分离分析研究通常采用气相色谱法和高效液相色谱法进行[4-6]。

非水毛细管电泳 (NACE)，作为毛细管电泳一个相对较新的分支，近年来备受分析工作者的青睐[11-14]。与水介质毛细管电泳相比，非水毛细管电泳有以下优越性：允许使用大孔径的毛细管柱进行分离分析；体系较低的电流允许使用高电压以缩短分离时间；增大疏水物质溶解度，减少毛细管壁对其的吸附，有效降低焦耳热。董玉明等以4-氯-7-硝基-2,1,3-苯并氧杂恶二唑 (NBD-Cl) 为柱前衍生试剂，采用激光诱导荧光检测器实现了丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸和缬氨酸四种氨基酸的非水毛细管电泳分离[7]。本文采用2-[2-(7H-二苯并[a,g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯 (DBCEC-Cl)[8]作为氨基酸衍生化试剂，首次实现了15种氨基酸衍生物的非水毛细管电泳分离，结果满意。

1 实验

1.1 仪器与试剂

HP-3D毛细管电泳仪，美国 Agilent公司(毛细管总长58.5 cm，有效长度50 cm，内径50 μm)。

氨基酸，美国 Sigma公司；甲酰胺(分析纯)，天津市广成化学试剂有限公司；乙腈(色谱纯)，山东禹王集团化工厂；水为 Milli-Q 超纯水；其它试剂皆为为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

DBCEC-Cl的配制：精确称取20.9 mg DBCEC-Cl，用色谱纯乙睛溶解后定容于10 mL容量瓶，配成5×10-3mol/L 溶液。

氨基酸标准溶液的配制：精确称取一定量的氨基酸标准品，用 6 mol/L盐酸溶解，然后 6 mol/L 氢氧化钠溶液调节至pH为中性或弱碱性，再用 pH为9.0的硼酸缓冲溶液定容到所需体积，即得到1.0×10-2mol/L 的单一氨基酸标准溶液，各种低浓度氨基酸的标准溶液用上述硼酸缓冲液稀释配制。标准溶液置于4 ℃冰箱内保存。

1.2.2 氨基酸的衍生化

依次取50 μL pH 为9.0的硼酸缓冲液 (0.1 mol/L)， 20 μL混合氨基酸标准溶液 (5×10-3mol/L)，120 μL衍生试剂(5×10-3mol /L)于2 mL安瓿瓶内，振荡混合均匀，密封后于40 ℃水浴中衍生20 min，然后用20 μL 50 %的乙酸水溶液调节pH为弱酸性，放至室温，进样分析。衍生化反应如图1所示。

图1 2-[2-(7H-二苯并[a, g]咔唑)-乙氧基]-乙基氯甲酸酯(DBCEC-Cl)与氨基酸衍生化反应

1.3 实验条件

不同浓度的乙酸、乙酸铵缓冲溶液由甲酰胺为溶剂配制而成。在不同电压和温度下，采用290 nm二极管阵列检测，分别对氨基酸衍生物进行分离。实验前对缓冲溶液进行超声脱气处理。每次进样前，按顺序用0.1 mol/L NaOH溶液(5 min)、超纯水(5 min)，缓冲溶液(3 min)冲洗毛细管柱。更换缓冲液时，需分别用上述三种溶液冲洗10 min。

2 结果与讨论

2.1 电解质的选择

在有机溶剂中加入电解质使其具有导电性是实现非水毛细管电泳分离的必要条件。常用的电解质有乙酸铵、乙酸镁、三羟甲基甲酰胺、甲酸、柠檬酸、甲磺酸等，其中乙酸铵比较常用，一般还需加入乙酸共同调节介质的酸碱缓冲性能。缓冲溶液浓度的大小可以明显影响电渗流、焦耳热、离子强度、电解质的粘度和毛细管壁对分析物的吸附，有效改善分离效果。因此，本实验选用常用的乙酸铵-乙酸体系为电解质，分别对乙酸铵、乙酸浓度进行了优化。

2.1.1 乙酸铵浓度对分离的影响

在固定其它实验条件下，以鸟氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、异亮氨酸(IIe)、脯氨酸(Pro)、羟脯氨酸(Pro-OH)为代表，考察了乙酸铵缓冲体系在60～80 mmol/L浓度范围内对四种氨基酸衍生物迁移时间、分离度和理论塔板数的影响(见图2a，2b，2c)。可以看出，迁移时间随着乙酸铵浓度的增加而延长。乙酸铵浓度为70 mmol/L时，虽然迁移时间相对60 mmol/L和65 mmol/L较长，但理论塔板数较高，分离度也较为理想，故选择70 mmol/L作为乙酸铵最佳分离浓度。

图2 乙酸铵浓度对迁移时间(a)、分离度(b)和理论塔板数(c)的影响

2.1.2 乙酸浓度对分离的影响

在固定乙酸铵浓度的前提下，调节乙酸的浓度可显著改变分析物粒子间的作用力，改善分离。在固定其他实验条件的情况下，以鸟氨酸(Orn)、亮氨酸 (Leu)、异亮氨酸 (IIe)、脯氨酸(Pro)、羟脯氨酸(Pro-OH)为代表考察了乙酸浓度在0.55～0.75 mol/L范围内对迁移时间、分离度和理论塔板数的影响(见图3a，3b，3c)。由图3可知，迁移时间随乙酸浓度的增加呈现先减小后增大的趋势，在0.65 mol/L时迁移时间最短。与此同时，理论塔板数和分离度也较为理想，故选择0.65 mol/L为乙酸最优分析条件。

图3 乙酸浓度对迁移时间(a)、分离度(b)和理论塔板数(c)的影响

2.2 电压对分离的影响

分离电压在毛细管电泳分离中有着重要作用，可直接影响电渗流大小、焦耳热、分离度和迁移时间等。与水介质毛细管电泳相比，非水毛细管电泳的电流和焦耳热相对较小，从而允许使用较高的分离电压。当然，分离电压过高也会导致焦耳热的影响加剧，柱效下降。实验比较了24 kV、27 kV和30 kV电压下对衍生物的分离影响(见图4)。结果显示，迁移时间随电压的升高而明显缩短，部分衍生物分离度有所增加，基线稳定性和焦耳热未见明显变化，因此选定30 kV为最优实验电压。

图4 电压对氨基酸衍生物分离的影响

2.3 温度对分离的影响

毛细管电泳分离过程中保持柱温恒定，可在一定程度上散逸分离过程中产生的焦耳热和改善分离。在较高温度下操作，可缩短分离时间，亦可克服某些难溶性分析物的不足。但柱温过高，不仅会导致有机溶剂的挥发，还会导致较大的焦耳热，使柱效降低，从而导致分离效率降低。实验温度考察范围为 12～21 ℃，发现在18 ℃时基线较为平稳，重现性好，最终选定18 ℃为毛细管柱温度。