尹霜霜，李 隽

（湖南中医药高等专科学校附属第一医院口腔科，株洲 412000）

牙髓炎是临床常见疾病之一，其主要是由于牙齿龋坏引起的一种炎症反应，牙髓中革兰阴性菌可释放脂多糖（LPS）等多种毒性产物从而影响牙髓干细胞的生物学功能[1]。牙髓干细胞具有高度自我更新能力及多向分化能力，并可在牙髓自我修复过程中分化为牙本质细胞[2]。牙齿龋坏可影响牙髓细胞的生物学功能，而牙髓干细胞在牙体再生过程中发挥重要作用[3-4]。目前关于影响人牙髓干细胞增殖、分化能力的基因研究相对较少，因而本研究从分子水平探究基因对人牙髓干细胞增殖、成脂分化能力的影响及其调控机制。研究表明，微小RNA（microRNA，miRNA）可调控人牙髓干细胞增殖、成脂分化过程[5]。相关报道指出，HOXC10 是同源异型盒基因（homeobox genes，HOX）的家族成员，HOXC10 可促进绵羊骨髓间充质干细胞的增殖并减少脂质积累[6]。但HOXC10对体外人牙髓干细胞增殖和成脂分化的调控作用尚未阐明。因此，本研究主要探讨HOXC10 在成脂诱导后人牙髓干细胞中的表达状态，探究其对人牙髓干细胞增殖及成脂分化的影响及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

α-MEM培养基购自美国Gibco；Dispase酶与Ⅰ型胶原酶购自美国Sigma；Lipofectamine2000 购自美国Invitrogen；si-HOXC10、si-con购自苏州吉玛生物；Trizol试剂购自美国Ambion；反转录试剂盒与荧光定量PCR 试剂盒购自北京TaKaRa；成脂诱导液购自美国Gibco；Transwell 小室购自美国Corning；MTT购自上海晶抗生物；兔抗人HOXC10抗体购自美国Abcam公司；兔抗人PPARγ、C/EBP-α抗体购自上海钰博生物；兔抗人GSK3β、β-catenin 抗体购自美国Cell Signaling Technology；二抗购自武汉博士德生物。牙体组织来源：收集20例本院口腔科拔除的智齿或因正畸拔牙，选取无牙体及牙周组织疾病的牙体组织，将牙体组织置于含有青霉素与链霉素双抗的培养基中，置于-80 ℃超低温冰箱保存。本研究经本院伦理委员会批准，所有患者知情且签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 人牙髓干细胞分离培养及实验分组 人牙髓干细胞分离培养：取出冻存牙体组织，PBS 清洗，使用无菌骨凿、鼓锤沿着牙体长轴纵行避开牙体，取出牙髓组织，剪去根尖，置于无菌离心管内（15 mL），采用PBS冲洗，剪碎牙髓组织（1 mm3），4 ℃条件下经600 r/min离心3 min，弃上清，加入Ⅰ型胶原酶液与Dispase 酶液，37 ℃消化15 min，加入含有胎牛血清的培养基终止消化，4 ℃条件下经600 r/min离心3 min，弃上清，平铺于培养皿底部，置于37 ℃恒温培养箱培养，待细胞生长至80%融合时进行传代培养[7]。取生长状态良好的第三代细胞，待细胞生长至80%融合时，加入胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于96 孔板（100 μL/孔），分别将si-HOXC10、si-con转染至人牙髓干细胞，分别记作si-HOXC10 组、si-con 组，同时将未经转染的人牙髓干细胞记作NC组。转染方法参照Lipofectamine2000试剂说明书进行操作。

1.2.2 细胞成脂诱导 采用PBS 缓冲液洗涤转染24 h 后的人牙髓干细胞，加入0.125%胰蛋白酶消化，加入1 mL含有15%胎牛血清的培养基制备细胞悬液，调整细胞密度后接种于24孔板（6×104个/孔），置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，使用含有青霉素与链霉素双抗的PBS缓冲液洗涤细胞，弃PBS，每孔加入0.8 mL 成脂诱导液，每隔3 d 更换一次成脂诱导液，诱导21 d。

1.2.3 qPCR 检测细胞中HOXC10、PPARγ、C/EBPα mRNA 的表达水平 收集诱导前、成脂诱导后及转染后各组人牙髓干细胞，采用Trizol 法提取细胞中的总RNA。根据反转录试剂盒说明书操作将总RNA 反转录合成cDNA，反转录体系：RNA 2 μL，10×RT Buffer 2 μL，dNTP 0.4 μL，Multiscripe RT 1 μL，10×Random Primer 2 μL，RNase-Free ddH2O补足体系至20 μL；反应条件：25 ℃10 min，37 ℃60 min，95 ℃5 min，4 ℃保存。HOXC10 正向引物5’-ACAGACCTCAATCGCTCAGGA-3’，反向引物5’-AGGGGTAAATCTGGATACTGGC-3’；PPARγ 正向引物5’-CTGCGTCCCCGCCTTATTAT-3’，反向引物5’-GGCATTGTGAGACATCCCA-3’；C/EBP-α正向引物5’-TCACTTGCAGTTCCAGATCG-3’，反向引物5’-TTGACCAAGGAGCTCTCAGG-3’；β-actin正向引物5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’，反向引物5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’。以cDNA为模板进行qRT-PCR反应，qRT-PCR反应体系：cDNA 2 μL，Real-Time Master Mix 10 μL，正反向引物各1 μL，RNase-Free ddH2O 补足体系至20 μL；反应条件：95 ℃2 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃30 s（循环40次），HOXC10、PPARγ、C/EBP-α均以βactin 为内参，用2-ΔΔCt法计算HOXC10、PPARγ、C/EBP-α mRNA相对表达量。

1.2.4 MTT 检测细胞增殖 取对数期人牙髓干细胞每孔5×103个细胞的密度接种于96 孔板，按照“1.2.1”项实验分组处理后，分别于成脂诱导1 d、3 d、5 d 时每孔加入MTT 试剂20 μL，继续培养4 h，离心后弃培养基，每孔加入150 μL DMSO，应用酶标仪检测OD。

1.2.5 Transwell 小室实验检测细胞迁移 收集各组人牙髓干细胞，调整细胞密度为2.5×104个/mL，向Tranwell 小室的下室加入600 μL 培养液，取100 μL 人牙髓干细胞加入Tranwell 小室的上室，Tranwell小室插入培养液中，置于37 ℃恒温培养箱培养24 h，取出Tranwell 小室，吸干上室液体，转移至含有800 μL 甲醇中，使用甲醇固定迁移到Tranwell 小室下层的细胞，固定15 min，流水冲洗，应用显微镜观察迁移到膜下层的细胞，计算细胞迁移数。

1.2.6 酶标仪检测细胞黏附能力 采用PBS 按照（1∶8）比例稀释Ⅰ型胶原（50 mg/L），按照每孔50 μL 加入96 孔板，4 ℃条件下孵育24 h，吸出Ⅰ型胶原，PBS 洗涤，加入含有1%牛血清白蛋白，置于37 ℃恒温培养箱培养1 h，每孔加入含有100 μL 转染后的人牙髓干细胞的培养液，置于37 ℃恒温培养箱培养30 min，细胞饥饿处理24 h，收集细胞置于无菌离心管内，4 ℃条件下经1 000 r/min 离心5 min，弃旧培养液，加入不含血清的培养液重悬细胞接种于96 孔板（5×104个/孔），每组设置3 个复孔，置于37 ℃恒温培养箱培养90 min，吸出孔内培养液，PBS洗涤，采用4%多聚甲醛固定5 min，PBS 洗涤，加入0.5%甲苯胺蓝染色5 min，蒸馏水洗涤，加入100 μL醋酸（33%），匀速振荡15 min，应用酶标仪检测各孔在595 nm 波长处的吸光度值（OD 值）。实验重复3次。

1.2.7 Western blotting 检 测HOXC10、PPARγ、C/EBP-α、WNT 通路相关蛋白GSK3β、β-catenin 的蛋白表达 RIPA 蛋白裂解液提取各组人牙髓干细胞总蛋白，蛋白样品中加入5×SDS 上样缓冲液，沸水煮10 min，蛋白变性。取50 μg 蛋白样品进行10%SDS-PAGE 分离蛋白，转膜、封闭，加入HOXC10（1∶1 000）、PPARγ（1∶800）、C/EBP-α（1∶800）、GSK3β（1∶800）、β-catenin（1∶1 000）与内参β-actin（1∶1 000）一抗稀释液，4 ℃条件下孵育过夜，TBST洗膜，加入二抗稀释液（1:5 000），滴加ECL，暗室内曝光显影，应用Quantityone软件检测条带灰度值。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以（）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 人牙髓干细胞诱导成脂分化过程中HOXC10基因表达

与成脂诱导前相比，成脂分化诱导后人牙髓干细胞中HOXC10 mRNA 及蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），PPARγ、C/EBP-α 的表达水平显著降低（均P＜0.05），见图1、表1。

表1 成脂分化诱导液对人牙髓干细胞成脂分化过程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表达 ，n=9

表1 成脂分化诱导液对人牙髓干细胞成脂分化过程中HOXC10 mRNA、HOXC10mRNA、PPARγ和C/EBP-α mRNA表达 ，n=9

图1 人牙髓干细胞诱导成脂分化过程中HOXC10、PPARγ和C/EBP-α蛋白表达

2.2 沉默HOXC10对人牙髓干细胞活性的影响

与si-con 组相比，si-HOXC10 组人牙髓干细胞活性显著降低（P＜0.05），见图2、表2。

图2 沉默HOXC10后人牙髓干细胞中HOXC10蛋白表达

表2 沉默HOXC10对人牙髓干细胞活性的影响 ，n=9

表2 沉默HOXC10对人牙髓干细胞活性的影响 ，n=9

与si-con组相比较，*P＜0.05。

2.3 沉默HOXC10 对人牙髓干细胞迁移和细胞黏附的影响

相较于si-con 组，si-HOXC10 组人牙髓干细胞迁移细胞数显著增多（P＜0.05），细胞黏附能力显著升高（P＜0.05），见表3。

表3 沉默HOXC10 对人牙髓干细胞对迁移和细胞黏附能力的影响 ，n=9

表3 沉默HOXC10 对人牙髓干细胞对迁移和细胞黏附能力的影响 ，n=9

与si-con组相比较，*P＜0.05。

2.4 沉默HOXC10 对人牙髓干细胞对成脂分化的影响

与si-con 组相比，si-HOXC10 组人牙髓干细胞中PPARγ、C/EBP-α 的表达水平显著降低（均P＜0.05），见图3。

图3 沉默HOXC10 对人牙髓干细胞中PPARγ 和C/EBP-α蛋白表达的影响

2.5 沉默HOXC10对人牙髓干细胞WNT通路的影响

与si-con 组相比，si-HOXC10 组人牙髓干细胞WNT 通路中GSK3β 蛋白水平显著降低（P＜0.05），β-catenin蛋白水平显著升高（P＜0.05），见图4。

图4 沉默HOXC10对人牙髓干细胞WNT通路GSK3β 和βcatenin蛋白的影响

3 讨论

人牙髓干细胞具有多向分化的能力，在一定条件下可增殖分化为成骨细胞、脂肪细胞等多种细胞，LPS 可通过激活单核巨噬细胞而诱导牙髓系统中的细胞释放炎症因子从而引起宿主的炎症反应，研究表明A20 基因沉默可抑制人牙髓干细胞增殖及分化能力[8-10]。但仍有多种基因可参与人牙髓干细胞增殖及分化过程，因而本研究探寻新型基因并分析其对人牙髓干细胞增殖及分化的影响。

HOXC10 与其天然反义转录物LncRNA HOXC-AS3 相互作用可调节间质/基质细胞的成骨作用[11]。HOXC10可抑制间充质干细胞的成骨分化潜能[12]。相关报道指出，HOXC10 可作为区分羊膜和蜕膜间充质干细胞的潜在标志物[13]。以上研究结果提示，HOXC10 在细胞成骨分化过程中发挥重要调控作用。本研究结果显示，成脂诱导后人牙髓干细胞中HOXC10的表达水平显著降低，成脂相关蛋白PPARγ、C/EBP-α 的表达量显著降低，提示HOXC10 表达量降低可能参与人牙髓干细胞成脂分化过程。本研究结果显示，沉默HOXC10后人牙髓干细胞增殖活力显著降低，提示沉默HOXC10可抑制人牙髓干细胞增殖。进一步研究发现，沉默HOXC10 后人牙髓干细胞迁移能力与细胞吸附能力明显增强，提示沉默HOXC10可促进人牙髓干细胞迁移及增强吸附能力。研究表明，成脂分化主要是指脂肪组织中的细胞增殖、分化转换成能够储存脂类的细胞的过程，PPARγ、C/EBP-α表达下调可抑制成脂分化的发生[14-15]。本研究结果显示，沉默HOXC10 表达后人牙髓干细胞中PPARγ、C/EBP-α表达水平降低，提示HOXC10 可能通过上调PPARγ、C/EBP-α 的表达从而促进人牙髓干细胞的成脂分化。

WNT 通路可调控细胞增殖、迁移，还可调控间充质干细胞及胚胎肝细胞的自我更新及分化，研究表明，WNT通路在牙齿发育及牙源性干细胞增殖分化等方面发挥重要调控作用[16]。相关报道指出GSK3β、β-catenin 是WNT 通路的主要蛋白，抑制WNT 通路可通过上调GSK3β 表达及下调β-catenin表达从而上调PPARγ、C/EBP-α 的表达进而促进牙髓干细胞的成脂分化[17]。研究表明通过下调WNT通路的表达可促进人牙髓干细胞的成骨向分化及成牙本质向分化[18]。本研究结果显示，沉默HOXC10 后人牙髓干细胞中WNT 通路相关蛋白GSK3β 的表达水平降低，β-catenin 的表达水平升高，提示沉默HOXC10 可能通过激活WNT 通路进而抑制牙髓干细胞的成脂分化。

综上所述，成脂诱导的牙髓干细胞中HOXC10低表达，沉默HOXC10可抑制牙髓干细胞增殖及成脂分化，并可促进牙髓干细胞的迁移及细胞黏附，其作用机制可能是通过激活WNT 通路而发挥作用，可为进一步揭示人牙髓干细胞增殖及成脂分化的分子机制奠定理论基础。但关于HOXC10 在人牙髓干细胞增殖及成脂分化过程中的具体作用机制仍需进一步探讨。