彭 辉，周红敏，张弓乔，王宏翔

（1.凤阳山管理处，浙江 龙泉 323700；2.龙泉市林业科学研究院，浙江 龙泉 323700；3.中国林业科学研究院 林业研究所，国家林业和草原局林木培育重点实验室，北京 100091；4.广西大学 林学院，广西 南宁 530000）

微生物分布广泛，在任何生境中几乎都可以生存，是地球上生物多样性最多的生命形式[1-2]。土壤真菌是分解者中的先锋物种，在森林生态系统中参与物质循环、能量流动等[3-5]。真菌群落的结构变化是生态系统恢复的重要指标[6]。相关研究表明，土壤中真菌群落的变化跟土壤中的氮磷等营养元素[7]和pH 值[8]等理化性质有关,且真菌对土壤环境的变化比细菌更为灵敏[9]。

红豆树Ormosia hosiei是我国特有种，为国家Ⅱ级濒危重点保护物种[10]。红豆树树形优美，木材光滑坚硬、纹理美丽，具有极高的材用、景观和森林文化价值。目前，对红豆树的研究主要为遗传多样性研究[11-12]、容器苗规格和施肥量[13]等方面的研究。刘燕等[14]对红豆树根围深色有隔内生真菌的分离、鉴定及接种效应进行了报道，但不同林龄红豆树土壤中真菌群落组成尚未揭示。本研究以不同林龄的红豆树为研究对象，通过Illumina Miseq 测序技术，分析研究不同林龄红豆树土壤真菌群落结构和多样性，以期为红豆树的培育和保护提供科学依据。

1 研究区概况

试验研究地位于浙江省龙泉市林科院基地内，地理坐标为28°01′58″N，119°05′33″E，海拔252 m，该研究样地属于中亚热带季风气候，年均气温17.7℃，年均降水量1 646.9 mm，年均相对湿度79%。年均无霜期261.2 d；年均温17.7℃，极端最高温41.5℃，极端最低温为-8.5℃。该区分布有杉木Cunninghamia lanceolata、红豆树和木荷Schima superba等森林资源。

2 研究方法

2.1 样地设置和样品采集

采集土样的时间为2020年5月，采用空间替代的方法，按照S 形取样在红豆树幼龄林（7 a）、中龄林（20 a）和成熟林（45 a）林分内分别设置3 个20 m×20 m 的标准样地，幼龄林、中龄林和成熟林分别标记为记为A、B、C，3 个林龄的红豆树林地势均较为平坦，土壤为红壤，林下植被均为草本，幼龄林的草本以多为蕨类，中龄林和成熟林的草本以麦冬居多。3 个林龄的坡向均为东南方向，中龄林的地势相对缓和，幼龄林和成熟林坡度在31°～35°，幼龄林、中龄林和成熟林的平均树高分别为4.9、8.1 和14.5 m。平均胸径分别为7.8、12.1、29.7 cm。每个样地内土壤取样采用5 点取样法，除去地表枯落物，采集0～20 cm处土样，将5 个取样点的土样等量混合，每个林龄作为1 个处理，每个处理3 个重复。将土样分为两份，一份放入无菌自封袋后及时保存在-80℃冰箱，用于土壤细菌群落高通量测定；另一份风干后（过2 mm 筛）用于土壤理化性质测定。

2.2 土壤理化性质测定

土壤理化性质分析采用《土壤农业化学分析方法》[15]。全氮采用AA3-连续流动分析仪测定；全磷采用UV2450-紫外分光光度计测定；全钾采用FP6410-火焰光度计测定；有机质采用重铬酸钾外加热法测定；有效磷采用UV2450-紫外分光光度计测定，碱解氮采用碱解-扩散法测定；pH值由（德国）赛多利斯-pb-10-pH 计测定。

2.3 土样DNA 测序和PCR 扩增测序

土壤总DNA 进行抽提采用Omega Bio-Tek 公 司 的E.Z.N.A.® Soil DNA Kit 试剂盒，从0.5 g 的土样中用1%琼脂糖凝脂电泳进行DNA 的完整性检验。DNA 的纯度和浓度采用NanoDrop2000 进行检测。真菌引物为SSU0817F（5′-TTAGCATGGAATAATRRAATAGGA-3′） 和1196R（5′-TCTGGACCTGGTGAGTTTCC-3′）对真菌V5-V7 区进行扩增[16]。包括：各4 μL 5×FastPfu 缓冲液和FastPfu 缓冲液，2 μLdNTPs（2.5 mmo/L），各0.8 μL 上下游引物，DNA 模板10 ng。ddH2O 20 μL。PCR 扩增条件为：95℃3 min 预变性，然后95℃ 30 s 变性，55℃ 30 s，72℃ 45 s，9 个循环，最后72℃延伸10 min。由Miseq 平台进行测序，委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

2.4 数据分析

原始测序序列采用fastp[17]进行质控，优化序列通过使用UCHIME 软件剔除嵌合体得到[18]。样品多样性指数（Shannon 指数、ACE 指数、Chao1指数等）使用Mothur（1.30.2）软件进行分析，采用SPSS 19.0 软件对不同处理的差异显著性进行分析。门和纲水平的真菌群落丰度采用Excel 2010 软件进行绘图，土壤理化性质与土壤真菌群落相关性采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）。

3 结果与分析

3.1 不同林龄土壤理化性质

由表1可知，有机质、全磷和pH 值在3 个林龄间不存在显著差异（P＞0.05）。中龄林土壤中全氮、碱解氮的含量最高，幼龄林和成熟林土壤全氮的含量分别是成熟林的33.89%、63.33%，幼龄林和成熟林土壤碱解氮含量分别是中龄林的42.09%、71.86%。成熟林土壤有效磷的含量显著高于其它2 个林龄，为4.24 mg/kg，幼龄林和中龄林土壤的有效磷含量分别是成熟林的0.08%和63.92%。幼龄林土壤中全钾的含量最高，为10.39 g/kg，全钾含量和其它2 个林龄的土壤全钾含量存在显著差异（P＜0.05）。成熟林土壤中的速效钾含量最高，幼龄林和中龄林土壤中速效钾含量分别是成熟林的75%和92.11%。

表1 不同林龄土壤理化性质†Table 1 Soil physicochemical properties of different stand ages

3.2 真菌高通量测序数据分析

从3 个不同林龄的红豆树土壤中获得有效序列条数为461 505 条，平均长度为381 bp。3 个林龄土壤样品的覆盖度均在99.9%以上，从图1可知，红豆树3 个不同林龄的稀释曲线随着测序数量的增加渐趋于平坦，说明本次实验获取了土壤样品的大部分信息，测序结果真实地反映了真菌群落的情况。

图1 真菌群落稀释曲线Fig.1 Rarefaction curve analysis of OTUS

3.3 土壤真菌群落的Alpha 多样性

Shannon 指数和Simpson 指数常用来估算土壤样品中微生物的Alpha 多样性，ACE 指数和Chao1 指数是生态学中估计生物物种总数和菌群丰富度的常用指数。3 个林龄土壤真菌的Shannon 指数存在显著差异（P＜0.05），幼龄林土壤真菌Shannon 指数最高。3 个林龄土壤真菌的ACE 指数、Chao1 指数为中龄林＞成熟林＞幼龄林，幼龄林的ACE 指数和Chao1 指数显著低于中龄林和成熟林（P＜0.05），中龄林和成熟林间的真菌数量和相对丰度差异不显著。成熟林的Simpson 指数显著高于幼龄林和中龄林（P＜0.05），说明成熟林的真菌群落分布更集中。

3.4 真菌群落组成分析

3 个林龄土壤样品中共检测出真菌门26 个，其中共有真菌门20 个，占总量的76.9%。3 个林龄土壤中含有的真菌门数分别为22、25、23。3 个林龄的土样中真菌门丰度超过1%的有5 个（图3），按照丰度高低为子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）、毛霉菌门（Mucoromycota）、unclassified_d__Eukaryota、unclassified_k__Fungi。3 个林龄的土壤样品的优势菌门均在95%以上。通过对真菌优势菌门丰度的显著差异分析，幼龄林土壤中担子菌门丰度与和中龄林存在显著差异（P＜0.05），与成熟林土壤担子菌门丰度存在极显著差异（P＜0.01），在成熟林土壤中担子菌门丰度最大。幼龄林土壤中毛霉菌门的丰度最大，与成熟林土壤中毛霉菌门的丰度存在显著差异（P＜0.05）。3 个林龄的红豆树样品中共检测出真菌纲67 个，真菌纲丰度在1%以上的有11 个，分别为银耳纲（Tremellomycetes）、粪壳菌纲（Sordariomycetes）、散囊菌纲（Eurotiomycetes）、伞菌纲（Agaricomycetes）、古菌根菌纲（Archaeorhizomycetes）、norank_p__Mucoromycota（未分类毛霉菌纲）、unclassified_d__Eukaryota、unclassified_k__Fungi、锤舌菌纲（Leotiomycetes）、座囊菌纲（Dothideomycetes）、unclassified_p__Ascomycota。幼龄林土壤中银耳纲丰度与中龄林存在显著差异（P＜0.05），与成熟林存在极显著差异（P＜0.01），成熟林土壤中银耳纲丰度最高。幼龄林土壤中粪壳菌纲和散囊菌纲丰度与其它2 个林龄存在显著差异（P＜0.05），粪壳菌纲在中龄林土壤中丰度最大，散囊菌纲在幼龄林土壤中丰度最高。幼龄林土壤中古根菌纲丰度最高，且和其它2 个林龄存在极显著差异（P＜0.01）。幼龄林土壤中伞菌纲丰度最大，且与成熟林存在显著差异（P＜0.05）。norank_p__Mucoromycota、锤舌菌纲和座囊菌纲在3 个林龄中差异不显著（P＞0.05）。

图2 门和纲水平下的真菌物种Venn 图像Fig.2 Venn map of fungal community at phylum level (A) and class level (B)

图3 门和纲水平下优势菌的相对丰度Fig.3 The relative abundance of dominant fungal at phylum and class level

表2 不同林龄土壤真菌多样性分析Table 2 Analysis of fungal community diversity in the soil of different forest stand ages

3.5 群落多样性与环境因子的相关关系

表3为土壤真菌多样性指数与土壤理化因子的相关性分析。由表4可以看出，Shannon 指数与全钾呈极显著负相关，与pH 值呈显著负相关。ACE 指数与有效磷呈显著正相关，与全钾呈极显著负相关。Chao1 指数与有效磷和速效钾均呈显著负相关。Simpson 指数与有效磷和速效钾均呈显著正相关。

表3 土壤真菌多样性指数与土壤理化性质的相关系数†Table 3 Correlation coefficients between soil fungal diversity index and soil physicochemical properties

3.6 环境因子对土壤真菌群落结构的影响

通过RDA 分析可知（图4），第一和第二排序轴的解释率为96.61%。通过各环境因子对第一排序轴和第二排序轴的投影分析，速效钾对真菌群落的影响最大，其次为有效磷、再次为全钾和pH 值，有机质对真菌群落的影响最小。由表4可知，有效磷、速效钾和全磷对毛霉菌门（Mucoromycota）呈显著负相关。速效钾对担子菌门（Basidiomycota）呈极显著正相关，有效磷对担子菌门（Basidiomycota）呈显著正相关。

表4 土壤优势真菌门相对丰度和土壤理化性质相关关系Table 4 Correlation between soil physicochemical properties and dominant phyla in fungal community

图4 土壤真菌与土壤理化性质的冗余分析Fig.4 Representative difference analysis of the relationships between soil physicochemical properties and fungal communities

4 讨 论

4.1 不同林龄对土壤真菌群落结构影响

本研究中子囊菌门和担子菌门是占绝对优势的2 个菌门，在3 个林龄中两者的丰度之和为84.2%～90.2%，与呼伦贝尔沙区4 种生境[19]中子囊菌门和担子菌门是优势菌群的研究结果一致。子囊菌和担子菌属于高等真菌，均适生于透气性好的酸性土壤。子囊菌大多数是腐生菌，可以将林分中较难降解的角质素等进行分解，对森林生态系统养分循环具有重要作用[21]。在本研究中3 个林龄的红豆树林土壤均为酸性，中龄林的pH 值最低，其次为成熟林，最高的为幼龄林，子囊菌门在pH 值最高的幼龄林土壤中相对丰度最高，这与邓娇娇等[20]子囊菌门在pH 值最低的油茶林分中相对丰度较高的研究结果不同。子囊菌门在3 个林龄土壤中的丰度表现为幼龄林＞中龄林＞成熟林，可能是因为幼龄林的郁闭度较低，而子囊菌门的进化速率优于担子菌门，具有较耐辐射等特性[22]，更适生于郁闭度低的环境。Chao1 指数和ACE 指数则表现出随着pH 值的升高真菌数量和相对丰度下降的趋势，这与杨立斌等[23]对大兴安岭兴安落叶松的研究结果相似。成熟林的Shannon 指数最低，Simpson 指数最高，说明成熟林土壤中真菌多样性低且分布比较集中，可能跟成熟林的根系较发达，对土壤的影响作用较大有关。

4.2 土壤理化性质对土壤真菌群落及多样性的影响

土壤中氮和磷的含量和土壤微生物活性密切相关[24-25]。幼龄林土壤中子囊菌的丰度最高，本研究与邓娇娇等[26]对辽东山区两种针叶人工林中子囊菌门在高pH 值、低速效钾的土壤中相对丰度较高的研究结果相一致。不同林龄红豆树土壤真菌多样性差异显著，研究表明，土壤微生物多样性不仅和物种数相关，还与物种分布的均匀度有紧密联系[27]。幼龄林的Shannon 指数显著高于中龄林和成熟林，幼龄林土壤真菌多样性最高，但ACE 指数、Chao1 指数又显著低于其它2 个林龄，幼龄林的Simpson 指数最低，可能是因为幼龄林中虽然物种数量较少，但土壤真菌的分布比较均匀有关。群落多样性与环境因子的相关关系和RDA 分析表明，对土壤真菌群落具有显著影响的4 个因子为速效钾、有效磷、全钾和pH 值。速效钾对真菌群落结构特征的影响最大，其次为全钾。优势真菌门相对丰度和土壤理化性质相关关系表明，速效钾和有效磷均与担子菌门呈正相关，与毛霉菌门呈显著负相关。与张沛健等[28]的研究结果相似，本研究的土壤中有机质和全氮含量表现为中龄林＞成熟林＞幼龄林。中龄林的Chao1指数和ACE 指数最高，说明中龄林的真菌数量和相对丰度最大，与中龄林的土壤养分含量高有关，为真菌的生长繁殖提供较优的条件。本研究中得出的不同林龄红豆树真菌群落结构特征，对评价红豆树人工林土壤质量演替变化和土壤微生态系统具有重要意义。但3 个不同林龄红豆树林中还有部分真菌的序列未检出，在接下去的研究中还需要进行进一步分析鉴定，以期为解决长期种植红豆树导致的地力衰退提供理论依据。

5 结 论

1）幼龄林、中龄林和成熟林3 个林龄土壤真菌多样性和相对丰度差异显著，幼龄林土壤中真菌多样性高且分布均匀；中龄林土壤真菌的数量和丰度最大。中龄林和成熟林土壤真菌群落间的差异较小，变化趋势相对一致。

2）3 个林龄的土壤样品中共检测到真菌有26个门，67 个纲，101 个目，127 个科，145 个属。子囊菌门和担子菌门是占绝对优势的2 个菌门，2个丰度之和占真菌总量的74.2%～90.2%。3 个林龄土壤中前三的优势菌为银耳纲、粪壳菌纲和散囊菌纲，其中幼龄林土壤中散囊菌纲的丰度最高，中龄林土壤中粪壳菌纲的丰度最高，成熟林土壤中银耳纲丰度最高。中龄林的土壤理化性质优于幼龄林和成熟林，土壤真菌数据和相对丰度高于其它2 个林龄。土壤速效钾、有效磷、全钾和pH值是影响3 个林龄土壤真菌群落结构的主要因子。建议随着红豆树种植年限的增加，在红豆树经营中，要适当施用磷肥和钾肥。研究结果为不同林龄红豆树土壤肥力和土壤微生物群落结构研究提供了理论支撑。