杨新杰，赖艳琼，李秋旸，张艳丽，王红斌，庞鹏飞，杨文荣

（1.云南民族大学生物基材料绿色制备技术国家地方联合工程研究中心,昆明650500；2.迪肯大学生命与环境科学学院,吉朗3217,澳大利亚）

微囊藻毒素（Microcystins，MCs）是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素，是湖泊蓝藻产生的一类肽类毒素，由于其毒性大、分布广且结构稳定，成为水环境中的潜在危害物质，对公众健康和水体环境构成巨大威胁［1］.微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，MC-LR）是一种环状七肽肝毒素，是目前已知毒性最强、危害最大且最为常见的一种蓝藻毒素［2］.微囊藻毒素-LR含有5种非蛋白原和2个可变位置的亮氨酸（L）和精氨酸（R）（化学结构式见本文支持信息图S1），是最早被化学鉴定和广泛研究的微囊藻毒素［3，4］.长期接触微囊藻毒素-LR污染的饮用水或农产品可导致哺乳动物肝脏的损伤，并通过抑制蛋白磷酸酶1和2A（PP1和PP2A）的活性而促进肿瘤的发生［5，6］.由于其毒性强且存在广泛，1998年世界卫生组织（WHO）规定饮用水中微囊藻毒素-LR的可接受上限水平为1µg/L［7］.因此，开发一种简单、灵敏、快速且可靠的检测低浓度微囊藻毒素-LR的分析方法，对保证水质和保护人类健康具有重要意义.

迄今，人们已经开发出多种检测微囊藻毒素-LR的分析技术，常见的有高效液相色谱-质谱法（HPLC-MS）［8，9］、蛋白磷酸酶抑制法（PPIA）［10，11］、酶联免疫吸附法（ELISA）［12~14］及化学与生物传感器法［15~25］.虽然这些检测技术和方法的准确度和灵敏度较高，但需要昂贵的仪器、训练有素的人员和耗时的操作过程，意味着其应用通常局限于资源充足和集中的实验室.因此，有必要建立一种简单、灵敏且特异的微囊藻毒素-LR的检测方法.近年来，基于抗原和抗体之间高特异性和有效识别的荧光分析技术引起了研究者的关注，构建出了不同类型的荧光传感分析技术并用于微囊藻毒素-LR的检测［26~29］.荧光金属纳米团簇（Metal nanoclusters）是一类新型的发光纳米材料，由几个到几百个金属原子组成，是介于金属原子和金属纳米颗粒之间的过渡形态［30］.由于其尺寸接近电子的费米波长，金属纳米团簇具有独特的物理性质和化学性质，如优异的光致发光和良好的水溶性等.与传统的荧光有机染料和半导体量子点相比，荧光金属纳米团簇具有毒性小、发光强度高、抗光漂白性能强及光学性能稳定等优点，在生物传感、催化、标记、成像和治疗等领域具有广阔的应用前景［31~33］.银纳米簇（Silver nanoclusters）是一种具有荧光的纳米团簇［34］，由于其相对简便的制备方法、超小的尺寸、较强的荧光及荧光量子产率和高稳定性，成为目前备受关注和研究最广泛的金属纳米簇，已被用于细胞成像、离子检测和化学传感等领域［35~38］.与传统的有机荧光染料和有毒的荧光量子点相比，银纳米簇具有毒性低、荧光性能稳定、生物相容性好、发射波长可调和易于制备等优点，广泛用于荧光传感分析中［34］.

本文以微囊藻毒素-LR适体单链及其互补链形成的环状DNA为模板，制备了环状DNA-银纳米簇（Circular DNA-AgNCs）荧光探针，构建了一种无酶无标记检测微囊藻毒素-LR的荧光传感分析新方法，实现了对微囊藻毒素-LR的快速和超灵敏检测.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

微囊藻毒素-LR（Microcystin-LR，编号：PN 300632）、微囊藻毒素-RR（Microcystin-RR，编号：PN 300636）和微囊藻毒素-LA（Microcystin-LA，编号：PN 300628）均购于上海普迈生物科技有限公司；硝酸银（AgNO3）和硼氢化钠（NaBH4）购自国药集团化学试剂有限公司；实验设计的寡核苷酸链由宝生物工程（大连）有限公司合成并纯化，碱基序列见表1；所用试剂均为分析纯，实验用水为灭菌去离子水.

Table 1 Sequence of designed DNA

F-7000型荧光光谱仪（FL，日本株式会社日立制作所）；TU-1950型紫外-可见分光光度计（UV-Vis，北京普析通用仪器有限责任公司）；JEM-2100型透射电子显微镜（TEM，日本电子株式会社）；WFH-203B型暗箱式三用紫外分析仪（上海驰唐电子有限公司）；SC805型全自动凝胶成像系统（上海山富科学仪器有限公司）；TGL-16G型离心机（上海安亭科学仪器厂）.

1.2 环状DNA⁃AgNCs的制备

参照改进后的文献［39，40］方法制备环状双链DNA-AgNCs荧光探针.将0.5µL 200µmol/L Apt和0.5µL 200µmol/L cDNA与25µL 50 mmol/L磷酸盐（PBS）缓冲液（pH=7.4）混合，于金属浴中95℃加热5 min，迅速冰水浴淬火5 min，35℃下杂交反应3 h；加入68µL去离子水稀释后，加入3µL 400µmol/L AgNO3，室温避光反应30 min；再缓慢加入3µL 400µmol/L NaBH4，4℃避光反应4 h，得到环状DNA-AgNCs.cDNA-AgNCs的制备方法同上，不加入cDNA，不需要杂交反应.

1.3 凝胶电泳实验

在垂直电泳板中注入7 mL质量分数为20%的非变性凝胶［含30%（质量分数）丙烯酰胺、H2O、5×Tris-硼酸（TBE）缓冲液（pH=8）、10%（质量分数）过硫酸铵和N，N，N'，N'-四甲基二乙胺（TEMED），体积比为50∶10∶15∶0.2∶0.02］，室温下聚合至梳齿中出现2条折光线.取5µL 1µmol/L的不同DNA溶液，加入1 µL 6×DNA上样缓冲液，混合均匀后，注入样品孔，在1×TBE缓冲液中，于50 V下先预跑30 min，待DNA完全跑上胶后，调节电压至100 V，再跑3 h.电泳结束后，将胶取下浸泡于3×Gene Ruler DNA Ladder溶液中30 min，最后在全自动凝胶成像系统中显像.

1.4 微囊藻毒素⁃LR的检测

将100µL环状双链DNA-AgNCs溶液加入到不同浓度的目标物MC-LR中，于35℃下孵育5 min，测定其荧光光谱.设置激发波长为555 nm，扫描570~700 nm范围内的光谱，扫描速率为250 nm/min，激发和发射狭缝均设置为5 nm.

实际水样的测定：取3种不同水样（自来水、河流水和湖水），用0.2µm的滤膜过滤，灭菌处理后，同上述方法测定MC-LR的浓度，并进行加标回收实验.

2 结果与讨论

2.1 荧光探针的检测原理

环状DNA-AgNCs荧光探针的制备及检测MC-LR的原理如Scheme 1所示.实验设计了2条寡核苷酸链，MC-LR适体链（Apt）和Apt的互补链（cDNA）.其中，cDNA的两端［5'-端和3'-端，富含胞嘧啶（C），斜体部分］作为单链DNA模板用于合成AgNCs，中间部分分别与Apt两端碱基互补（红色标注，蓝色标注）.cDNA与Apt杂交后，形成一种环状双链DNA结构（见本文支持信息图S2）.环状双链DNA外侧未杂交的5'-端和3'-端富含胞嘧啶（C）作为单链DNA模板可用于合成AgNCs（DNA-AgNCs）.当存在目标物分子MC-LR时，由于MC-LR与环状双链DNA中的Apt高特异性和高亲和力结合，导致环状双链DNA解体，释放出的cDNA-AgNCs在610 nm处呈现强荧光.根据环状双链DNA-AgNCs荧光强度变化与目标分析物MC-LR浓度之间的关系，实现对目标物MC-LR的定量检测.

Scheme 1 Schematic illustration of the detection principle for MC⁃LR based on circular DNA⁃AgNCs fluorescent probe

2.2 环状双链DNA⁃AgNCs的表征

由图1（A）可见，DNA-AgNCs分散度较好，尺寸分布较为均匀，平均粒径为2 nm左右，表明形成的环状双链DNA可用于合成DNA-AgNCs.图1（B）为环状双链DNA-AgNCs的荧光光谱和UV-Vis光谱，其中谱线a为环状双链DNA-AgNCs的荧光激发光谱，激发波长为555 nm，谱线b为DNA-AgNCs的荧光发射光谱，发射波长为610 nm.在环状双链DNA-AgNCs的UV-Vis光谱中，555 nm处有一个强的特征吸收峰（谱线c），且与荧光激发峰对应.合成的环状双链DNA-AgNCs在365 nm紫外灯下呈现红色荧光，在可见光下呈现无色（见本文支持信息图S3），实验结果表明已成功制备了环状双链DNA-AgNCs.

Fig.1 TEM image(A),fluorescent(a,b)and UV⁃Vis absorption(c)spectra(B)of circular DNA⁃AgNCs

2.3 荧光探针的可行性分析

为了验证实验的可行性，研究了环状双链DNA-AgNCs体系荧光强度在加入MC-LR前后的变化.由图2可见，当不存在MC-LR时，环状双链DNA-AgNCs在610 nm处几乎不产生荧光发射峰（谱线a）；当加入500µg/L MC-LR时，环状双链DNA-AgNCs的荧光强度显著增强（谱线b）.结果表明，环状双链DNA-AgNCs可以作为荧光探针，根据探针荧光信号的增强实现对MC-LR的定量分析.

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，进一步研究了环状双链DNA-AgNCs探针荧光强度改变的机理（见本文支持信息图S4）.Apt不仅直接可以与cDNA杂交，还可以与cDNA-AgNCs中的cDNA杂交产生新的泳带，当存在MC-LR时，由于MC-LR与环状双链DNA中的Apt结合，导致新泳带的亮度降低（泳带4和泳带6），表明环状双链DNA解体，与上述探针的荧光强度增加相一致.

Fig.2 Fluorescent spectra of circular DNA⁃AgNCs in absence(a)and presence(b)of 500µg/L MC⁃LR at an excitation wavelength of 555 nm

2.4 实验条件的优化

为了获得最佳的荧光分析性能，对AgNCs合成条件、Apt与cDNA杂交条件和MC-LR检测条件分别进行了优化（见本文支持信息图S5）.在AgNCs合成过程中，当n（DNA）∶n（AgNO3）∶n（NaBH4）=1∶12∶12、AgNO3反应时间为30 min、NaBH4加入时间为4 h时，制备的AgNCs探针荧光强度均达到最大值［图S5（A）~（C）］.随着Apt与cDNA-AgNCs杂交时间的增加，体系荧光强度逐渐减小，3 h时基本达到稳定［图S5（D）］.杂交温度为35℃时，Apt与cDNA-AgNCs杂交后，体系荧光强度变化最大［图S5（E）］.荧光探针检测目标物MC-LR时，随着孵育时间的增加，荧光强度逐渐增大，50 min时基本趋于稳定［图S5（F）］.孵育温度为35℃时，体系荧光强度变化最大［图S5（G）］.因此，本实验中Apt与cDNA-AgNCs杂交时间和杂交温度分别选择3 h和35℃，MC-LR与环状DNA-AgNCs孵育时间和孵育温度分别选择50 min和35℃.

2.5 微囊藻毒素⁃LR的测定

Fig.3 Fluorescent response curves and calibration curve

在上述优化实验条件下，测定环状DNA-AgNCs荧光探针对不同浓度MC-LR的荧光响应（图3）.由图3（A）可见，随着MC-LR浓度的增加（0，0.005，0.01，0.05，0.1，0.5，1，5，10，50，150，200，500µg/L），环状DNA-AgNCs的荧光强度逐渐增大.环状DNA-AgNCs探针的荧光强度与MC-LR浓度在0.005~500µg/L范围内呈良好的线性关系［图3（B）］，其线性方程为F=57.56lgc+198.12，检出限（S/N=3）为1.7 ng/L，相关系数（R2）为0.9969.表S1（见本文支持信息）对比了本文工作与已报道工作检测MC-LR的分析效能，由表S1可见，本文工作具有线性范围宽和检出限低的特点，且荧光探针具有制备简单、无需荧光标记等优点.

2.6 干扰实验

为了评价环状DNA-AgNCs荧光探针检测MCLR的特异性和选择性，考察了水体中MC-LR共存的2种异构体（MC-RR和MC-LA）对荧光探针检测的影响.由图4可见，当MC-LR浓度为20µg/L时，5倍过量的MC-RR和MC-LA对荧光探针的测定干扰较小，表明制备的荧光探针具有良好的抗干扰能力和选择性，可用于实际样品的分析测定.

Fig.4 Anti⁃interferent experimental results of circular DNA⁃AgNCs fluorescent probe

2.7 实际样品的测定

为了验证该荧光探针对实际样品中MC-LR检测的可行性，选取3种水样（自来水、河流水和湖水）作为实际样品，采用加标回收法测定荧光响应和回收率.水样经0.2µm的滤膜过滤，灭菌处理后，测定其对MC-LR的荧光响应，测定结果如表S2（见本文支持信息）所示.该荧光探针测定实际水样中MCLR的回收率为95.9%~108.5%，且相对标准偏差（RSD）为1.30%~4.15%，表明环状DNA-AgNCs荧光探针对实际水样中MC-LR的测定具有可行性.

综上所述，本文以MC-LR适体单链及其互补链杂交形成的环状DNA为模板，成功制备了环状DNA-AgNCs无酶无标记荧光探针，用于MC-LR的传感检测.设计的互补链既可与MC-LR适体链杂交形成环状DNA，又可作为模板用于AgNCs的合成.当存在目标物MC-LR时，MC-LR与环状DNAAgNCs荧光探针中适体链高亲和性和高特异性结合，导致环状结构解体，探针荧光强度增强.结果表明，制备的环状DNA-AgNCs荧光探针可用于MC-LR的荧光传感分析检测.该法具有灵敏、无需任何标记和操作简单等优势，为环境水样中MC-LR的快速和准确测定提供了一种新的方法.

支持信息见http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210471.