刘洪岩，薛晖，张世勇，赵彦华，王明华，边文冀，陈校辉

（江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017）

细胞内核糖核酸（RNA）的合成和降解必须达到一个微妙的平衡，破坏这种平衡会对细胞功能产生重大影响[1]，在这一平衡中，基因的转录调控和转录后降解起到同样重要的作用。RNA降解涉及许多复杂且相互关联的途径，其中RNA酶起到了重要作用。除了作为一种基因调控手段，RNA酶还可以清除异常信使核糖核酸（mRNA），以防止有毒蛋白质产品的积累。此外，大多数初级转录本都经过RNA酶的剪切，才能产生具有多种功能的成熟RNA。

Rrp44是一种高度保守的3’到5’外切RNA酶，是RNA外切酶复合体的催化亚基[2]。Rrp44在RNA代谢中具有多种功能，包括mRNA质量控制[3]、基因表达调控[4]和小RNA加工[5]，同时，Rrp44在生物体水平上与染色体分离[6]，B细胞中抗体的多样化相关。现简述Rrp44的结构及分子和生物学功能。

1 Rrp44的结构、功能以及亚细胞定位

Rrp44同源物属于核糖核酸酶Ⅱ（RNase II）超家族，该家族成员具有很高的序列保守性和功能保守性[5]。Rrp44由一个具有外切酶活性RNB结构域、两个CSDS结构域、一个S1结构域、一个具有内切酶活性PIN结构域以及N端含有三个半胱氨酸残基的CR3结构域[6]组成。

Rrp44是一种高效的RNA酶，从3’到5’端水解单链RNA，一次释放一个核苷酸。Rrp44外切酶的活性主要依赖RNB催化中心的4个保守的天冬氨酸残基以及与其相互作用的两个镁离子[7]，该位点埋在狭窄通道的底部，只有含有7个以上核苷酸的单链RNA才能通过该结构域；同时，RNB活性位点可以识别具有分子内或分子间二级结构的底物，只要在RNA的5’端有4～5 nt的未配对核苷酸，Rrp44就可以进行降解。催化结构PIN的活性位点由四种酸性氨基酸组成，它们与两种二价金属阳离子结合。PIN结构域不能降解双链RNA，但是环状和线性单链RNA都是它的底物[8]。

核酸酶的亚细胞定位是RNA表达后调控的重要机制。一般认为Rrp44位于核内，但是在细胞质中也发现少量的Rrp44。然而不同种类的细胞，Rrp44的亚细胞定位不同，在一些果蝇S2细胞中，Rrp44存在于细胞质中，在HEK-293细胞系Rrp44仅在细胞核中表达。同时，Rrp44还可以根据细胞周期进程或生长条件的变化改变其亚细胞定位。Rrp44的细胞核定位是由C端两个核定位信号控制的。N端结构域似乎也有助于Rrp44亚细胞定位，但是N端不存在核定位序列[9]。目前认为，N端结构域可能包含一个额外的调控序列，可能通过稳定蛋白的三级结构，从而使C端核定位信号发挥作用。

2 Rrp44的分子功能

RNA的不断合成和降解是细胞功能正常的代谢变化，该过程与外切酶复合体相关。Rrp44在mRNA质量控制、基因表达调控和小RNA加工中发挥作用。

2.1 Rrp44在mRNA降解中的作用

真核生物的mRNA降解涉及许多复杂而相互关联的途径，它们都汇聚在三种共同的机制上。mRNA降解首先必须消除二级结构，变成单链的RNA，再通过脱腺苷化作用删除polyA尾巴，从而被Rrp44从3’端开始降解；脱去5’端的帽子结构，被核糖核酸外切酶从5’端开始降解。最后，转录本可以通过核内裂解产生两个片段，这两个片段容易被Rrp44或RNA酶XRN1降解。在mRNA降解途径的上游，还存在着许多其他途径，以便靶向底物至特定的途径，从而进行降解[3]。这些上游途径可分为质量控制和转录后调控两条路径。

（1）Rrp44在RNA质量控制通路中的作用。细胞必须检测异常和错误的转录本，以防止产生潜在的有毒蛋白质。监视机制存在于细胞核和细胞质中，以检测mRNA产生和成熟的所有阶段的错误。在细胞核中，由于转录、加工或输出错误会导致出现错误的mRNA，这些错误的mRNA都会被降解。3’—5’和5’—3’途径都参与核mRNA降解，但具体使用哪一种途径取决于底物特异性。目前研究结果表明，外切酶复合体可特异性降解未剪接的mRNA前体[3]和转录错误的mRNA。

细胞质中发生的mRNA监视途径则依赖于翻译，包括无义介导的mRNA降解（nonsense-mediated mRNA decay,NMD）、无终止降解（non-stop decay,NSD）和停滞降解（no-go decay,NGD）。NMD降解是由包含一个提前终止密码子（PTC）的转录本触发的，随后，相关蛋白结合到被降解的转录本，导致mRNA通过5’—3’或3’—5’途径降解[10]。NSD降解以缺乏终止密码子的mRNA为目标，这类mRNA翻译时，核糖体会沿着polyA尾巴继续翻译。在酵母和哺乳动物细胞中，mRNA3’端的核糖体被GDP结合蛋白Ski7检测到，接下来Ski7会招募Ski复合体和外切酶复合体并降解转录本[11]。NGD降解则阻止了具有强二级结构的转录本的翻译。当核糖体被mRNA的强二级结构中止后，mRNA在核内被裂解。这一过程中相关的内切酶尚未确定，目前认为真核翻译释放因子eRF1和eRF3相关蛋白Dom34和HSB1[4]参与其中。一旦转录本被分裂成两个片段，它会被外切酶复合体或RNA酶XRN1降解。

（2）Rrp44在转录后调控中的作用。mRNA降解是一种基因表达调控的方式。这种调控方式可以通过3’非翻译区中不稳定的顺式元件RNA诱导的沉默复合物（RISC）诱导发生。目前发现两种不稳定的顺式元件：富含AU的顺式作用元件（AU-rich elements,ARE）和富含GU的顺式作用元件（GUrich elements,GRE），它们大多存在于mRNA的3’非编码区中。ARE存在于介导细胞调节反应的短寿命mRNA中，如编码炎症因子的mRNA。ARE通过招募转录因子来影响转录后基因的表达。这些ARE结合蛋白与CCR4-NOT复合物结合，随后被Rrp44和外切酶体复合物降解[4]。GRE与ARE调节不同的基因库，并对mRNA的稳定性有更温和的影响[12]。

2.2 Rrp44在小RNA成熟和降解中的作用

随着对RNA降解的深入了解，已经有研究证实，并非所有RNA降解的目的都是将RNA底物完全降解。Rrp44和外切酶体复合物能够参与小RNA的加工。核糖体RNA（ribosomal RNA,rRNA）、小核仁RNA（small nucleolar RNA,snoRNA）、小核RNA（small nuclear RNA,snRNA）和转运RNA（transfer RNA,tRNA）均被转录为前体RNA，这些前体RNA必须经过剪切、修饰才能产生有功能的小RNA[13]。在这一过程中，外切酶复合体通过将前体RNA3’端降解，使其成为成熟的、稳定的RNA。

例如，酵母中的rRNA合成始于核仁中35S前体rRNA的合成。前体rRNA在细胞核内部经过一系列步骤被降解，产生一些更小的片段，包括7S中间体。外切酶体复合物对7S中间体进行加工，使其成为成熟的5.8SrRNA[14]。此外，Rrp44在酵母中特异性降解转移核糖核酸（tRNA）。在酵母中，甲硫氨酸转运RNA（tRNAiMet）58位的丙氨酸甲基化，对于其正确二级结构的形成至关重要，Rrp44能够特异性识别该位点，并在TRAMP（ir2/Mtr4 polyadenylation,TRAMP）复合物的帮助下对A58没有甲基化的tRNAiMet进行降解[15]。

miRNA介导的mRNA降解是调节基因表达的重要手段。miRNA能够结合到目的RNA片段上面，最终导致目的RNA被降解。因此，miRNA的产生受到多个水平的调控。研究发现，外泌体和Rrp44特异性地参与了某些miRNA的成熟过程，包括果蝇羽翼成熟需要的miR-252-5p，miR-982-5p。同样在果蝇中，一个miRNA家族被发现编码在内含子中，它们在外切酶复合体中被加工而不是通过正常的RNA酶Drosha裂解。此外，Rrp44还参与了哺乳动物细胞中前体miRNA的降解和前体miRNAs的质量控制[16]。

3 Rrp44的生物学功能

在Rrp44突变体中可以观察到其生物学功能，此类研究大多在酵母和果蝇中进行的。由于Rrp44在真核生物中明显保守，这意味着对低等生物的研究可能会对了解其在高等生物中的功能有所帮助。

3.1 Rrp44在细胞周期调控中的作用

Rrp44在调节细胞周期中起作用。Rrp44最初是在一个突变的裂殖酵母株中被发现，Rrp44突变后导致姐妹染色单体不分离[1]。随后发现，在单个Rrp44突变体中，有丝分裂节点控制蛋白Mad2抑制有丝分裂进程，但在Rrp44和Mad2双突变体中，由于染色体分离错误，导致产生非整倍体细胞[17]。进一步证明Rrp44的突变影响了微管定位和结构，从而影响了有丝分裂的进程。同时，在果蝇S2细胞中，敲除Rrp44也会影响细胞周期相关基因的表达[18]。目前认为，Rrp44主要参与着丝粒异染色质沉默，也因此影响细胞有丝分裂进程。

3.2 Rrp44在产生抗体多样性中的作用

在抗体重组的过程中，外切酶复合体能够招募脱氨酶。脱氨酶的功能是将甲基化的胞苷残基和5-羟甲基化的胞苷残基分别转化为尿嘧啶和胸腺嘧啶，然后被DNA修复机制识别并转化为定点断裂（DSBs），这是免疫球蛋白多样化过程的一部分[19]。由于脱氨酶只能作用于单链DNA（ssD NA），因此这些过程只发生在基因转录过程中。在这种修复过程中产生的RNA会被外切酶复合体降解。