王平，刘洋，黄伟，刘传炯

(1.四川省林业科学研究院，成都610081；2.画稿溪国家级自然保护区管理处，四川泸州646405)

2020年4月，在四川泸州画稿溪国家级自然保护区内海拔660 m的溪流附近，采集到4号(标本号:HGX2020022～HGX2020025)角蟾科Megophryidae标本(图1)，周围环境为苦竹Pleioblastusamarus与落叶阔叶混交林，微生境为流水崖壁下、石下以及有流水的草本植物丛中。结合分子系统发育重建及形态比较，确定该4号标本为角蟾科掌突蟾属Leptobrachella的毕节掌突蟾Leptobrachellabijie，系四川省两栖类新记录种。

1 方法

根据费梁和叶昌媛(2001)的测量方法，对4号标本进行了测量与记录，其他物种的形态数据来自Wang等(2019)。

将其中2号标本利用OMEGA试剂盒提取DNA，利用引物L3957/H4551(Simonetal.，1994)扩增16SrDNA基因序列。扩增体系为25 μL，95 ℃ 5 min；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 7 min，10 ℃结束。扩增产物送苏州金唯智公司测序，利用LaserGene.v7.1(DNASTAR Inc.，美国)及MEGA 7(Kumaretal.，2016)对获得的序列进行处理。基于测序获得的序列片段、在NCBI上下载的部分掌突蟾属物种以及外群东方锄足蟾Pelobatessyriacus、摩洛哥锄足蟾Pelobatesvaraldii序列，利用MrBayes 3.2.2(Ronquistetal.，2012)，最佳进化模型为GTR+I+G，由Partitionfinder 2.1.1基于Akaike Information Criterion (AIC)计算所得，及RaxmlGUI 1.5(Silvestro &Michalak，2012)，模型为GTRGAMMA，bootstrap设为1 000，其他参数保持默认，分别重建所采集标本的贝叶斯法和最大似然法系统发育关系树。同时利用MEGA 7计算物种及种群间的遗传距离，使用模型为Kimura 2-parameter，其他参数保持默认。

2 结果

4号标本体长为30.5～33.6 mm；背部棕褐色，具小疣粒；体侧具稀疏的不规则黑斑点；腿及前臂背面具3～4条褐色横纹；前后肢腹面紫黑色，具较密集的不规则灰白色斑点；腹部白色，具淡灰色斑点；腋腺白色；指间无蹼，趾间微蹼。

获得2条16SrDNA碱基序列，长度为564 bp。重建的贝叶斯系统发育树和最大似然树一致显示，该4号标本与毕节掌突蟾的模式标本聚为一支(图2)，并享有0.7%的遗传距离。

3 讨论

结合形态比较及分子系统发育研究，本次采自画稿溪国家级自然保护区的4号标本均为毕节掌突蟾，为四川省两栖类新记录。

掌突蟾属具有非常高的潜在物种多样性，近几年，我国学者至少描述了该属17个新种(中国两栖类，2020)。另一方面，掌突蟾属物种形态保守性非常高，使得仅靠形态比较进行分类研究往往导致误鉴定，不同的物种常常被鉴定为同一物种，并认为其广泛分布。利用综合的研究手段对掌突蟾属物种进行分类与分布研究应该提上日程。

致谢：本工作得到了画稿溪国家级自然保护区的支持，四川农业大学陈重光在野外工作中的帮助，宜宾学院郭鹏教授在分子实验上的帮助，在此一并致谢！