李伟艺， 刘红松， 高山瑛， 苏志强

（汉中市人民医院中医康复科，陕西汉中 723000）

急性心肌梗死（AMI）是临床常见的心血管疾病，通常会危及患者生命，已成为全球严重的公共卫生问题[1-2]。AMI的病因复杂，与患者的生活方式、饮食习惯、遗传因素、后天生存环境及机体病理生理状态均密切相关[3]。发生AMI后，及时采用溶栓治疗或经皮冠脉介入治疗是缩小心梗面积并改善临床结果的最佳、也是最有效的策略；然而，当前的临床数据显示，经皮冠脉介入治疗及二级预防性治疗后，患者的发病率和死亡率依然较高，且在恢复缺血心肌血流的同时极可能带来再灌注损伤，导致心肌细胞死亡。因此，寻找有效的AMI治疗及预防方法和药物至关重要[4-5]。AMI属于中医学“胸痹”的范畴，为本虚（气虚、阳虚）标实（痰浊、血瘀）病症。益气活血疗法常被用于中医临床治疗冠心病、动脉粥样硬化等心血管疾病[6-7]。本研究中的益气活血方由黄芪、当归、川芎、丹参4味药材组成，具有补气活血功效。本课题组前期临床研究发现，益气活血方治疗AMI患者，能够降低心肌损伤指标乳酸脱氢酶（LDH）、磷酸肌酸激酶（CK）、CK同工酶（CK-MB）的含量，提高左室射血分数。有研究表明，Wnt∕β-连环蛋白（β-catenin）信号通路与心脑血管疾病的发生发展密切相关，该信号通路的表达情况影响着心肌细胞的增殖、凋亡及炎症水平，抑制该信号转导途径的表达往往可取得较好的治疗效果[8-9]。因此，本研究以Wnt∕β-catenin信号通路为切入点，观察益气活血方对AMI大鼠心功能和结构的影响，探究其对AMI相关心肌损伤的修复作用及机制，现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物SPF级SD大鼠60只，雌雄各半，6～8周龄，体质量180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0006]。实验单位：陕西中医药大学实验动物中心[SYXK（陕）2021-001]。饲养环境：温度20~25℃，湿度50%~65%，光照∕黑暗12 h交替。

1.2 药物、试剂与仪器益气活血方（黄芪30 g、当归12 g、川芎15 g、丹参15 g，中药饮片购自汉中市人民医院），由汉中市人民医院药剂科制备成1.6 g∕mL的浓缩水煎液，4℃冰箱保存。Wnt-C59[Wnt∕β-catenin信号通路抑制剂，阿拉丁试剂（上海）有限公司产品，货号：SJ015EF497158]；苏木素-伊红（HE）、Masson及脱氧核苷酸末端转移酶（TdT）介导的核苷酸（dUTP）缺口末端标记法（TUNEL）染色试剂盒（博士德生物有限公司）；LDH、CK、CK-MB试剂盒（南京建成生物工程研究所）；反转录试剂盒、实时荧光定量多聚核苷酸链式反应（RT-qPCR）预混液（美国Thermo Scientific公司）；引物（日本Takara公司合成）；Wnt3a、β-catenin、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、C-myc兔单抗（武汉三鹰生物技术有限公司）。电泳仪，购自北京六一仪器厂；多普勒超声仪，购自美国Beckman公司；IX53型显微镜，购自日本奥林巴斯；多功能凝胶成像系统，购自美国Syngene公司；酶标仪，购自美国Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 分组与造模将60只大鼠按照随机数字表分为假手术组、模型组、中药组、Wnt-C59组，每组15只。模型组、中药组、Wnt-C59组大鼠按照文献[10]方法，采用结扎冠状动脉前降支法建立AMI模型，若心电图可见Ⅱ导联ST段较手术前抬高0.2 mV以上即可认为造模成功。经术后观察，模型组、中药组、Wnt-C59组大鼠各有14只、15只和14只造模成功。假手术组大鼠仅打开胸腔后缝合。各组大鼠均在造模后肌注4万U青霉素预防感染。每日1次，共3 d。

1.4 给药方法造模后第2天，中药组大鼠灌胃6.48 g∕kg益气活血方药液，给药剂量按照人和动物体表面积折算的等效剂量比率关系换算，Wnt-C59组大鼠灌胃30 mg∕kg Wnt-C59，假手术组和模型组大鼠灌胃20 mL∕kg 0.9%氯化钠（NaCl）溶液，1次∕d，共4周。

1.5 观察指标与方法

1.5.1 心功能指标检测末次给药后2 h，采用多普勒超声仪检测各组大鼠左室射血分数（LVEF）、左室短轴缩短率（LVFS）、左室收缩末期内径（LVESD）和左室舒张末期内径（LVEDD）。连续检测3个心动周期，取其平均值。

1.5.2 标本制备完成心电图检查后，各组大鼠尾静脉取血，于4℃冰箱静置2 h，以3 000 r∕min（离心半径为12.5 cm）离心10 min后取血清，用于酶联免疫吸附分析（ELISA）检测。处死大鼠，分离心脏，一部分心脏组织以40 g∕L多聚甲醛溶液固定，用于切片染色，余下的组织置于-80℃冻存，用于蛋白免疫印迹（Western Blot）和RT-qPCR检测。

1.5.3 HE染色检测心脏组织在40 g∕L多聚甲醛溶液中固定48 h后，蒸馏水清洗、梯度乙醇脱水后制作病理切片，切片厚度为4μm，脱蜡、复水后行HE染色，光镜下观察大鼠心肌组织病变。

1.5.4 Masson染色检测组织固定、病理切片制作、脱蜡和复水过程同“1.5.3”项。按照Masson染色试剂盒的操作步骤进行染色，光镜下观察心脏组织纤维化情况。

1.5.5 TUNEL染色检测组织固定、病理切片制作、脱蜡和复水过程同“1.5.3”项。严格按照TUNEL试剂盒的步骤对病理切片进行染色处理，并置于荧光显微镜下拍照记录，计算凋亡指数（AI）。AI（%）=阳性细胞数∕总细胞数×100%。

1.5.6 RT-qPCR法检测取大鼠心肌组织，研磨匀浆后加入TRIzol裂解液提取总RNA，使用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量模版。引物序列见表1。反应条件：95℃5 min，95℃30 s、62℃30 s、72℃30 s，扩增40个循环，最后72℃延伸10 min，4℃5 min终止反应。实验重复3次。根据2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequences

1.5.7 ELISA法检测取大鼠血清，严格按照试剂盒说明书步骤检测血清LDH、CK-MB、CK的含量。

1.5.8 Western Blot法检测取大鼠心脏组织，研磨匀浆后提取组织蛋白并测定蛋白浓度（BCA法），加入loading buffer混匀、煮沸使蛋白变性。取适量蛋白上样行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜后封闭2 h。然后将聚偏氟乙烯（PVDF）膜置于4℃环境下在Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc一抗稀释液（1∶1 000）孵育12 h，TBST缓冲液清洗。再把PVDF膜置于羊抗兔IgG二抗稀释液（1∶2 000）中37℃孵育2 h，TBST洗膜，均匀滴加适量发光液，放置于凝胶成像仪中显影拍摄。以GAPDH为内参，以目的蛋白的灰度值与GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达水平。

1.6 统计方法采用SPSS25.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多样本比较采用单因素方差分析（One way ANOVA），两样本比较采用LSD-t检测方法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心功能指标比较表2结果显示，模型组大鼠心功能指标LVEF和LVFS均低于假手术组，LVESD和LVEDD均高于假手术组（P＜0.05），而中药组、Wnt-C59组LVEF和LVFS值均高于模型组，LVESD和LVEDD值均低于模型组（P＜0.05）。

表2 各组大鼠心功能指标比较Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

表2 各组大鼠心功能指标比较Table 2 Comparison of cardiac function indexes of rats in various groups （±s）

①P＜0.05，与假手术组比较；②P＜0.05，与模型组比较

组别假手术组模型组中药组Wnt-C59组LVFS（%）42.55±3.39 16.68±2.25①24.32±2.48①②24.79±2.26①②鼠数（只）15 14 15 14 LVESD（mm）4.53±0.79 9.20±1.37①7.09±1.14①②7.16±1.20①②LVEDD（mm）6.90±0.95 10.49±1.39①8.55±1.19①②8.64±1.21①②LVEF（%）78.69±4.72 38.57±2.09①55.10±3.13①②56.67±3.01①②

2.2 各组大鼠心肌组织病理学变化比较图1结果显示，假手术组心肌组织结构正常、完整，心肌细胞分布均匀、有序，轮廓清晰可见，胞核与胞质边缘分明，血管管腔完整，部分血管周围有少量呈蓝色的胶原组织。与假手术组比较，模型组心肌组织HE染色着色较浅，有细胞轮廓不清晰和细胞破碎现象，组织的排列呈异常紊乱、无序状，并伴有炎症细胞浸润，Masson染色显示紫红色的心肌组织明显减少，存在大量呈蓝色的胶原纤维，血管破碎，部分血管呈管腔狭窄和闭合。与模型组比较，HE染色显示中药组和Wnt-C59组心肌组织排列较为整齐，着色相对更均匀，有少量炎症细胞浸润，血管管腔完整度较好，Masson染色显示中药组和Wnt-C59组以紫红色心肌组织为主，蓝色胶原纤维沉积现象显著减轻。

图1 各组大鼠心肌组织病理变化比较（HE染色法，×400；Masson染色法，×400）Figure 1 Comparison of pathological changes of myocardial tissue of rats in various groups（by HE staining，×400；by Masson staining，×400）

2.3 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较图2结果显示，假手术组大鼠心肌细胞几乎无凋亡，偶见胞核呈棕褐色的阳性染色细胞，而模型组大鼠心肌细胞AI值及阳性染色细胞数量均显著高于假手术组（P＜0.05），中药组、Wnt-C59组大鼠心肌细胞AI值及阳性染色细胞数量均显著低于模型组（P＜0.05）。

图2 各组大鼠心肌细胞凋亡情况比较（TUNEL法，×400）Figure 2 Comparison of apoptosis of rat myocardial cells in various groups（by TUNEL，×400）

2.4 各组大鼠心肌凋亡相关基因mRNA表达水平比较图3结果显示：模型组大鼠心肌Caspase-3、Bax mRNA表达水平显著高于假手术组，Bcl-2 mRNA表达水平显著低于假手术组（P＜0.05）；与模型组比较，中药组和Wnt-C59组Caspase-3、Bax mRNA表达水平降低，Bcl-2 mRNA表达水平升高（P＜0.05）。

图3 各组大鼠心肌凋亡相关基因mRNA表达水平比较Figure 3 Comparison of mRNA expression levels of rat myocardial apoptosis-related genes in various groups

2.5 各组大鼠血清LDH、CK、CK-MB含量比较图4结果显示，模型组大鼠血清LDH、CK、CK-MB的含量均显著高于假手术组（P＜0.05），中药组和Wnt-C59组血清LDH、CK-MB、CK含量均显著低于模型组（P＜0.05）。

图4 各组大鼠血清心肌损伤指标比较Figure 4 Comparison of serum myocardial injury indexes of rats in various groups

2.6 各组大鼠心肌组织Wnt∕β-catenin通路相关蛋白表达比较图5结果显示，模型组大鼠心肌组织Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达水平均显著高于假手术组（P＜0.05），中药组和Wnt-C59组Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、C-myc蛋白表达水平均显著低于模型组（P＜0.05）。

图5 各组大鼠心肌组织Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达比较Figure 5 Comparison of Wnt/β-catenin signaling pathway-related protein expression in myocardial tissue of rats in various groups

3 讨论

急性心肌梗死（AMI）属于中医学“胸痹”的范畴。年老体衰、饮食不节、寒邪内侵等均为其病因，基本病机为心脉阻闭不通，心失所养。本病病性为本虚标实，本虚指气虚、阳虚、阴虚，以心气虚为主；标实为痰浊、血瘀、气滞、寒凝，以血瘀为主[11]。气虚血瘀为该病的主要病机，因气虚而导致气血运行不顺，血停则瘀，抑或气血生化不足，气血运行中断，触发本病，因此，“益气”是治疗AMI的主要原则。临床研究表明，具有活血化瘀、行气开郁的中药方剂在治疗AMI时常能取得显著疗效，联合西医治疗也成为当前AMI治疗的常用方案[12-13]。本研究所用的益气活血方中，黄芪为君药，温阳补气，当归为臣药，可“破恶血、养新血”，川芎和丹参活血、行气、祛瘀，能祛风、通经、止痛，诸药相互为用，共奏补气活血之功效[14]。

LVEF、LVFS、LVESD和LVEDD是临床治疗中用于评价心脏功能的常用指标。AMI发生后，心脏的收缩力和舒张力显著降低，这些改变归因于心室壁局部缺血[15]。本研究结果显示，模型组大鼠心脏功能显著降低，有明显心室扩张和重构，益气活血方可改善大鼠心脏功能，减轻心室扩张。与细胞损伤和功能完整性丧失有关的LDH、CK、CK-MB等指标是评估心肌损伤和充血性心力衰竭的重要心肌酶，已被应用于临床诊断心肌梗死性疾病[16]。本研究结果显示，模型组LDH、CK、CK-MB含量均显著增加，益气活血方降低血清LDH、CK、CK-MB含量，可改善模型大鼠心肌损伤，减轻心肌组织胶原纤维沉积。另外，模型组大鼠心肌细胞凋亡显著，而益气活血方能够减轻细胞凋亡，且这一现象在Caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达的检测中得到验证。Bcl-2家族高度严格调控人体正常细胞和恶性细胞的死亡过程，其中包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡的效应蛋白Bax，Bcl-2和Bax可共同激活促凋亡蛋白Caspase-3及Caspase家族的其他因子，引起衰老和凋亡的发生[17]。本研究结果显示，模型组心肌Caspase-3、Bax mRNA表达水平升高，Bcl-2 mRNA表达水平降低，益气活血方可下调Caspase-3、Bax mRNA水平，上调Bcl-2 mRNA水平，提示益气活血方可减轻AMI导致的心肌损伤和细胞凋亡。

Wnt信号通路最初在癌症过程中被发现，其可调控人类和动物的多种病理生理过程，激活不同信号转导途径[18]。经典Wnt信号通路的功能异常与心脏疾病相关，如AMI、肥厚、心力衰竭、心律不齐及动脉粥样硬化等[19]。β-catenin是一种调节细胞转录和基因表达的蛋白，该因子的过度表达可加剧心脏损害，并恶化左心室收缩功能，抑制该通路可抑制心脏损伤后的纤维化过程，预防心力衰竭，因此，针对该信号通路的抑制措施被认为是具有心脏保护作用的[20-21]。本研究结果显示，模型组心肌Wnt3a、β-catenin的表达被显著上调，β-catenin靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表达也随之上升，益气活血方则抑制了Wnt3a、β-catenin表达，β-catenin的靶基因Cyclin D1、C-myc蛋白表达也随之减少。为了进一步探究益气活血方的作用机制，本课题组在实验中同时设立了Wnt-C59对照组。Wnt-C59是一种特异性针对Wnt信号通路的小分子化合物，可逆转激活的Wnt∕β-catenin信号通路，在肿瘤及心脏疾病中有显著作用，且治疗剂量下无明显毒性[22]。结果显示，Wnt-C59不仅抑制了Wnt∕β-catenin信号通路的活化，同样也改善了大鼠心脏功能，减轻心肌损伤和心肌细胞凋亡，降低血清心肌损伤指标LDH、CK、CK-MB的含量，益气活血方的作用效果与Wnt-C59相似，进一步提示益气活血方可能通过调控Wnt∕βcatenin途径发挥对AMI大鼠心肌损伤的修复和改善作用。

综上所述，益气活血方可改善AMI后引起的大鼠心肌损伤，其机制可能与调控Wnt∕β-catenin途径有关，而该调控过程中是否有其他相关信号通路的参与，仍需要进一步的研究。