姜水兵，努尔麦麦提·麦麦提敏

（塔里木大学动物科学学院，新疆 阿拉尔 843300）

圆环病毒在近些年备受兽医界的关注，圆环病毒科成员在颗粒形态及基因组方面均类似，但是在生态学、生物学、抗原性等方面差异比较大。关于鸭圆环病毒（DuCV）报道最早于2003年由德国学者Hattermann等［1］报道，随后2004年德国［2］、2005年匈牙利［3］也相继报道，自2007年起，在山东、江苏、四川、福建、广东、浙江、辽宁、重庆等省份陆续有鸭群感染DuCV报道［4］，DuCV感染后不仅可使鸭发生原发性感染，还会使鸭免疫系统受到损害，易遭受其他细菌和病毒的并发或继发感染，给全球养鸭业造成了巨大的经济损失［5］。因为DuCV在动物细胞和禽胚上的增殖培养方法尚未建立，故无法采用传统的病毒分离鉴定方法进行准确诊断，而根据流行病学、临床症状、病理变化等也只能做出初步诊断，确诊需借助实验室诊断方法。

杨晓伟等［6］研究发现鸭圆环病毒病在川渝地区存在低水平感染。广西同时存在基因1.1亚型、基因1.2亚型和基因2.1亚型3种不同的DuCV毒株流行，其中基因1.1亚型和1.2亚型为优势流行毒株［7］。江西部分地区鸭圆环病毒病的流行较为严重，且优势基因型为1型［8］。由于DuCV常以隐性感染形式存在，易被忽视，从而为DuCV的传播、适应与变异提供了更多机会。为明确DuCV在和田地区的感染与流行情况，本研究对和田地区疑似发病鸭群进行了DuCV的检测与全基因组测序分析，旨在了解DuCV流行毒株在和田地区的遗传变异情况和流行优势基因型，为和田地区防控DuCV提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品的采集 采自和田地区5个规模化养殖场15～30日龄的樱桃谷肉鸭，出现被羽脱落，生长迟缓等症状共100例病、死鸭样品，无菌收集包括肝、脾、法氏囊等组织脏器，-20℃保存备用。

1.1.2 试剂 主要试剂：DNA zol、ExTaq酶、DNA Marker DL 2000，北京全式金生物技术有限公司；Gold View，北京博奥拓达科技有限公司；pMD18-T Vector，宝生物工程（大连）有限公司；E.coliDH5α株感受态细胞，天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒DNA提取 将采集的肝、脾、法氏囊等器官组织样品使用消毒过的手术剪各剪取黄豆大小的组织块，将剪取的组织块倒入加有5倍体积生理盐水的研磨器中进行研磨，研磨后的组织液反复冻融3次，4℃8 000 r/min离心5 min，取上清并做好标记保存备用。处理好的样品按照DNA zol试剂盒操作说明书提取病毒DNA。

1.2.2 引物合成 杨育鹏［9］发表的DuCV-1、DuCV-2特异性引物，DuCV-F：5'-CGACTTATGTTATCT TTGGGCGT-3'，DuCV-1R：5'-AATTCTGCGGTACA GAGA（C）TGA-3'，DuCV-2R：5'-AGCCTCAGAAA ACCAGATAATGCG-3'，其中DuCV-F为DuCV基因型的共用上游引物，与DuCV-1R特异性扩增长度为398 bp，与DuCV-2R特异性扩增长度为811 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 DuCV双重PCR扩增、克隆及测序 PCR体系为25μL，其中模板DNA 2μL，上游引物0.5μL，下游引物各0.25μL，EasyTaqMix12μL，ddH2O10μL。PCR反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、52℃退火30 s、72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸补齐5 min，以阳性样本和ddH2O分别作阳性对照和空白对照。PCR产物取5μL经1.5%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，阳性产物经胶回收，连接到pMD18-T载体，转化宿主菌DH5α感受态细胞，经培养筛选，挑取单个转化菌落于LB培养液（Amp+）过夜培养，PCR鉴定阳性克隆菌送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。测序结果用DNAStar进行拼接分析。

1.2.4 DuCV基因组序列分析 运用DNAStar7和Mega5对所获得的和田毒株与GenBank中10个国内外DuCV毒株进行遗传进化分析和同源性比较。

2 结果与分析

2.1 DuCV基因组PCR扩增结果

从鸭组织中提取总病毒DNA后用合成的特异性引物进行双重PCR扩增，经过琼脂凝胶电泳，通过全自动凝胶成像分析仪中观察到了398 bp目的片段（图1），未出现811 bp片段。

图1 鸭圆环病毒PCR检测结果

2.2 DuCV基因部分序列同源性分析

测序结果通过应用DNAStar软件中的SeqMan对序列拼接，获得4株DuCV部分基因序列，选取一株DuCV基因部分序列以MN068360.1为目标序列，选取11株国内外参考基因，其中与源自山东MN068358.1、台湾KP229369.1、韩国KC851821.1同源性为100%，与韩国JQ740360.1、中国KC460533.1、广西MK814581.1同源性为99.3%（表1、图2）。

表1 参考DuCV毒株信息

图2 参考DuCV毒株部分序列构建的同源性对比

2.3 DuCV部分基因序列系统进化树

采用MEGA软件将目标基因与11株参考序列绘制系统发育进化树，由进化树可知，本试验获得的毒株与源自山东的MN068358关系较近，属于同一分支，与源自福建的GQ423740关系较远（图3）。

图3 参考DuCV毒株部分序列系统进化分析

2.4 DuCV与鸭肝炎病毒、鸭出血病毒、呼肠孤病毒混合感染情况

经过对所有样本进行PCR或RT-PCR检测，在20份DuCV阳性样本中，鸭肝炎病毒、鸭出血病毒、呼肠孤病毒的阳性率分别为10.00%（2/20）、30.00%（12/20）、5.00%（1/20）。剩余80份DuCV阴性样本中，鸭肝炎病毒、鸭出血病毒、呼肠孤病毒的阳性率分别为8.75%（7/80）、25.00%（20/80）、3.75%（3/80）。结果显示，DuCV阳性样品中鸭肝炎病毒、鸭出血病毒、呼肠孤病毒感染率均略高于DuCV阴性样本（表2）。

表2 DuCV阳性或者阴性样品中鸭肝炎病毒、鸭出血病毒及呼肠孤病毒混合感染情况

3 小结与讨论

自2003年德国学者Hattermann等［1］首次报道鸭圆环病毒以来，世界各地相继报道其流行病学。本试验采集和田地区5个规模化养殖场共100例病、死鸭样品进行鸭圆环病毒检测，结果表明，2021年采集的和田部分地区病、死鸭样品DuCV阳性检出率为20%，且优势流行毒株为DuCV-1，低于高攀攀等［10］2020年采集的山东省部分地区DuCV阳性检出率，同时与中国台湾、匈牙利等地的DuCV感染率也有一定差异，说明DuCV感染呈现地域差异性。

DuCV阳性样本与阴性样本中鸭肝炎病毒、鸭出血病毒及呼肠孤病毒混合感染的情况显示，DuCV阳性样本中鸭肝炎病毒、鸭出血病毒、呼肠孤病毒感染率均略高于DuCV阴性样本，表明DuCV病毒在侵入机体造成免疫损害后，易与其他病原微生物共染。

从DuCV毒株部分基因序列进化树分析，和田流行优势毒株与源自山东毒株关系最近，可能由于市场交易造成病原传播。和田养鸭产业属于国家扶持产业，种鸭、种蛋均由浙江大型养鸭场提供，建议养殖场在选择引进适合本地养殖种鸭品种与种蛋的同时，做好种鸭疫病检测、种蛋病原净化；加强饲养管理，改善饲养环境，使用中草药混合饲料，提高鸭群对疾病的抵抗力；做好DuCV-1型疫苗接种，定期检测抗体水平。