安东 王成丽 曹斌 卢炜 葛梦婷 杨将辉

（江苏农牧科技职业学院 225300）

鸡志贺氏菌病是志贺氏菌引发的一种细菌性痢疾病[1]，病原菌有鲍氏志贺菌、痢疾志贺氏菌等。鸡志贺氏菌病具有较强的传染性，且发病突然，病程短，主要通过消化道途径感染，幼龄雏鸡感染率和致死率最高[2]。病鸡感染后出现精神不振，采食量下降，水样腹泻，严重者夹杂血液，日龄越小雏鸡死亡率越高，整个病程可持续3～7d[3]。由于鸡志贺氏菌病对常用的链霉素有一定的耐药性，若用药不当会加重病情扩散，引发更多鸡只感染。由于该病原体可感染人类，对食用者肠道菌群健康具有破坏作用，必须做好鸡志贺氏菌病防治管理。本试验对江苏地区5 个规模化养殖场和散养农户进行随机抽样调查，通过平板凝集试验了解该地区志贺氏菌流行情况，为开展鸡志贺氏菌病的净化提供参考。

1 材料与方法

1.1 抗原和血清

鸡志贺氏菌平板凝集染色抗原、阳性血清和阴性血清由本实验室自行制备。

1.2 稀释液

0.15%的石炭酸生理盐水（pH7.2）由本实验室自行配制。

1.3 培养基

ss 琼脂平板培养基采购于浙江天杭生物科技股份有限公司。1%葡萄糖肉汤培养基为本实验室自行配制。

1.4 受检鸡群

检测血清来自于江苏地区的5 个规模养殖场、35 户农家散养XXX 鸡只，血清采集数量共700 份，其中规模养殖场500份，农家散养200 只。采血部位为鸡翅静脉，血清由血液高速离心获得，血清样本置于-20℃保存，每只鸡采血量为500uL。

1.5 制备抗原

（1）培养种菌：将纯化好的菌株接种到灭菌好的牛肉汤蛋白胨内，培养温度为37℃，培养时间为24h。

（2）细菌接种：将鲍氏志贺菌液均匀地涂抹在ss 琼脂平板培养基内，培养温度为37℃，培养时间为24h，促进病原菌大量繁殖。同样方法接种痢疾志贺氏菌。

（3）采集培养的细菌：培养过后可发现不同平板内均长满病原菌，两种病原菌培养基表面分别加入适量的稀释液至表面湿润，然后刮取表面病原菌，全部移入无菌瓶中。

（4）细菌灭活：鲍氏志贺菌液和痢疾志贺氏菌液分别置于121℃高压灭活，灭菌时间为2h30min。

（5）浓缩抗原：将抗原进一步浓缩，根据离心法将不同质量的物质进行离心，得到所需要物质，离心转速为每分钟4000r，离心时间为20min，用无菌吸管缓慢吸弃上清，该步骤充分多处直至上清液无杂质且清凉，最后弃掉全部上清液，保留管底菌体。

（6）调整浓度：最终抗原浓度为40 亿/ml，用无菌吸管将细菌分散开来。

（7）抗原染色：提取一部分溶液，将这部分溶液进行抗原染色。加入适量的碱性亚甲蓝染色液进行染色，充分混匀。

（8）保存方法：制备好的2 种不同的抗原菌放入冰箱冷藏保存，以备后续使用。

1.6 被检血清处理

采集的鸡只血清在检测前放置于56℃水浴锅内孵育30min进行灭活处理。

1.7 检测方法

采用平板凝集试验进行检测，试验开始前将所有血清（含待检测、阳性、阴性）及制备的抗原放置于室温条件下1h，让试剂温度较为均一，实验温度为25～30℃。用蜡笔将玻璃板平均分成6 格，将制备的鲍氏志贺菌凝集反应抗原滴加在前3 个格，第1 格内加入待检血清，第2 格加入鸡志贺氏菌病阳性血清（阳性对照），第3 格加入等量生理盐水（引性对照），将制备的痢疾志贺氏菌凝集反应抗原滴加在后3 个格，第4 格内加入待检血清，第5 格加入鸡志贺氏菌病阳性血清（阳性对照），第6 格加入等量生理盐水（引性对照）。每个反应时间为5min。

1.8 结果判断

阳性检查结果：整个液体血滴凝集成白色花斑状，凝集片或成片状凝集大小的颗粒，分布在液体血滴的各个边缘，肉眼观察较明显。

阴性试验结果：白色混合液仍然能保持原来的白色状态，或逐渐变成白色中心部分较浓的白色圆点状。

2 结果与分析

2.1 不同鸡场鸡志贺氏菌病感染调查结果

如表1 所示，在700 份待检血清中共检测出82 份鸡志贺氏菌病阳性血清，其中规模养殖场检测样本数量为500 份，阳性血清样本42 份，阳性率8.6%；农户散养检测样本数量为200份，阳性血清样本40 份，阳性率20.0%。从感染情况来看，规模养殖场鲍氏志贺菌感染数量为22 份（占比51.16%），痢疾志贺氏菌感染数量为15 份（占比34.88%），混合感染数量为6 份（占比13.95%）；农户散养鲍氏志贺菌感染数量为19 份（占比47.50%），痢疾志贺氏菌感染数量为12 份（占比30.00%），混合感染数量为9 份（占比22.50%）。

表1 不同养殖方式鸡志贺氏菌病感染情况调查

2.2 不同群体鸡志贺氏菌病感染调查结果

如表2 所示，商品鸡阳性率最高，383 份样本中检测阳性血清57 份，阳性率为14.88%，其次为后备母鸡，阳性率为8.98%，而种母鸡阳性率为7.14，种公鸡未检测出阳性鸡志贺氏菌病。从感染情况看，商品鸡鲍氏志贺菌感染数量为29 份（占比50.88%），而痢疾志贺氏菌感染数量为17 份（占比29.8 2%），混合感染数量为11 份（占比19.30%）；后备母鸡鲍氏志贺菌感染数量为11 份（占比50.0%），痢疾志贺氏菌感染数量为8 份（占比36.36%），混合感染数量为3 份（占比13.64%）。

表2 不同群体鸡志贺氏菌病感染情况调查

3 结论与讨论

试验自制的鸡志贺氏菌平板凝集染色抗原可用于检测鸡志贺氏菌，试验结果发现，不同养殖方式和饲养群体的鸡志贺氏菌病感染情况不同。从养殖方式看，规模化养殖场由于饲养方式较为科学，调查的5 个养殖场均采用分群饲养管理，且每周进行1～2 个鸡舍消毒工作，养殖人员进出鸡舍要更换衣物和清洁消毒，在养殖方式较为科学的条件下，规模化养殖场鸡志贺氏菌病阳性率明显低于农户散养模式。表明在管理粗放、卫生条件不良的条件下，鸡志贺氏菌病具有较高的发病率。若散养户不采用科学的饲养模式，缺乏定期消毒观念，会进一步加重鸡志贺氏菌病感染情况，增加鸡志贺氏菌病防治难度。

从养殖群体看，商品鸡感染鸡志贺氏菌病最严重，阳性率高达14.88%，而后备母鸡和种母鸡也存在感染情况。商品鸡发病率高的原因也和养殖方式有关，由于散养户主要养殖商品鸡，且养殖观念较为落后，疫苗接种不当会增加感染几率，甚至有散养户存在“不发病不接种”的错误思想，造成鸡群存在隐性感染鸡只。江苏地区应进一步加大科学养殖宣传工作，鼓励养殖户每年进行至少2 次鸡群检疫，及时淘汰病鸡和可疑鸡只，每周对鸡舍进行消毒，尤其是雏鸡要与不同日龄鸡分群饲养，这样可减少雏鸡鸡志贺氏菌病发病率和死亡率。