张 婷 王 琴 赖河宇 郭舜远 柳旭泽 方 云＊

(1.江南大学化学与材料工程学院，江苏无锡，214122；2.江南大学至善学院，江苏无锡，214122)

乳液体系在食品药品化妆品以及个人清洁和护理用品等领域有广泛应用。常规的乳液通常由表面活性剂稳定，这无疑会对环境以及产品的性能造成某些负面影响。20世纪初，Ramsden[1]在研究蛋白质分散体系时发现胶体尺寸的固体颗粒也能稳定油/水界面。随后，Pickering对固体颗粒稳定的乳液进行了研究[1]，因此这种乳液被称作Pickering乳液，而相应的能稳定油水界面的、具有双亲性的固体颗粒被称为Pickering乳化剂。近年来，以生物质颗粒稳定的Pickering乳液受到了更多的关注[2-4]，但目前研究集中在使用化学修饰或接枝聚合物链段等方法赋予生物质颗粒良好的双亲性及刺激响应性，这就导致乳化剂制备过程复杂且安全性降低，并使应用受限[5]。

共轭亚油酸(CLA)是一类天然存在的不饱和脂肪酸，具有多种生物活性，其结构中共轭双键和羧基共存使其具有自组装性、可聚合活性和弱还原性等性质[6-8]。本实验试图用CLA作为分子砌块构建稳定的自交联共轭亚油酸囊泡(SCLA-FAV)，使其有可能不需要经过其他化学修饰，直接用作新型生物质颗粒乳化剂稳定Pickering乳液，并探究该Pickering乳液对β-胡萝卜素的有效包埋能力以及减小其降解速度从而提高其保留率的效果。

1 实验部分

1.1 原料与仪器

共轭亚油酸(CLA，纯度95%)，大连医诺生物股份有限公司；白藜芦醇(纯度98%)，北京伊诺凯科技有限公司；葵花籽油、玉米油以及大豆油均购自上海嘉里食品工业有限公司；过硫酸铵(AR)、硼酸(H3BO3，AR)、硼砂(NaB4O7·10H2O，AR)、橄榄油(CP)均购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水(18.2 MΩ·cm)，由美国Millipore Synergy UV超纯水系统制备。透射电子显微镜(JEM-2100，日本JEOL公司)；紫外可见分光光度计(TU-1950，北京普析通用仪器有限公司)；高速分散机(IKA-T18，德国IKA公司)；超景深三维显微镜(VHX-1000C，香港Keyence有限公司)；手提紫外检测灯(ZF-7A，上海宝山顾村电光仪器厂)。

1.2 SCLA-FAV的构建及表征

用pH 8.6的硼酸-硼砂缓冲液配制一系列不同CLA浓度的缓冲溶液，测定234 nm处的紫外吸光度，绘制CLA浓度-吸光度标准曲线。同上配制30 mmol/L的CLA溶液，置于室温下自组装24 h，作为共轭亚油酸囊泡(CLA-FAV)储备液。分别准确量取10 ml的CLA-FAV储备液于25 ml圆底烧瓶中，加入41 μl 2.0 mol/L的过硫酸铵溶液并通氮气40 min以排除瓶中的氧气，将瓶口密封置于80 ℃油浴锅中引发囊泡发生不同时长的热聚合反应，以获得不同交联度的系列SCLA-FAV样品。用pH 8.6的硼酸-硼砂缓冲液将该系列样品以及自交联前的CLA-FAV储备液均稀释至0.03 mmol/L，测定234 nm处的吸收峰，并与上述标准曲线对照判断SCLA-FAV的交联度。将1滴SCLA-FAV样品滴在铜网上，用滤纸吸干多余的液体，室温晾干观察SCLA-FAV的TEM影像以判断其微观形貌。

1.3 以SCLA-FAV为乳化剂制备Pickering乳液

将SCLA-FAV样品作为Pickering乳化剂，油相为橄榄油(或分别以葵花籽油、玉米油、大豆油替换)，配制总体积为4 ml的油水混合液，其中油相体积分数分别为50%、60%、65%、70%、75%和80%；使用高速分散机在12000 r/min下均质5 min，24 h后观察乳液分相情况以确定最佳油/水比；将乳液用超纯水稀释20倍后在超景深三维显微镜下观测，使用“Nano Measurer”软件进行粒径统计。

1.4 Pickering乳液包埋活性物质

配制一系列不同浓度β-胡萝卜素的乙醇溶液，由于β-胡萝卜素在乙醇中的最大吸收波长为450 nm，因此测定450 nm处的紫外吸光度，绘制β-胡萝卜素的浓度-吸光度标准曲线。以橄榄油为溶剂于避光状态下配制不同浓度(mg/L)的β-胡萝卜素溶液，分别移取3 ml于玻璃瓶中，并加入1 ml的SCLA-FAV样品作为含乳化剂水相，使用T-18高速分散机在12 000 r/min下乳化5 min后避光保存，24 h后使用超景深三维显微镜观察乳液液滴大小；将油相含1000 mg/L的β-胡萝卜素的乳液在室温下暴露于365 nm紫外线下，每间隔1 h取出200 μl，用乙醇稀释后测定其在450 nm处的吸光度，与β-胡萝卜素的浓度-紫外吸光度标准曲线对照计算其中β-胡萝卜素的剩余浓度，据此计算β-胡萝卜素的保留率。

参照上述程序进行橄榄油(或以玉米油、葵花籽油、大豆油替代)包埋白藜芦醇的相关实验。

2 结果与讨论

2.1 交联时间对SCLA-FAV交联度的影响

本实验设计用CLA作为分子砌块，构建稳定的SCLA-FAV，其过程和原理示意图见图1。pH可调节脂肪酸分子间的氢键相互作用和羧酸根之间的静电作用，从而诱导脂肪酸发生自组装，在pH 8.6时CLA可自发形成不饱和脂肪酸囊泡(Ufasome)。CLA中含有的共轭双键在234 nm处有特征吸收，并不受自组装的影响。根据这一特点，测定不同浓度的CLA-FAV溶液在234 nm处的紫外吸收，从而得到CLA-FAV浓度-吸光度的标准曲线(图2A)。采用热聚合法引发30 mmol/L的CLA-FAV溶液中共轭双键自交联，80 ℃下聚合不同时间后SCLA-FAV的紫外光谱图见图2B，其在234 nm处的特征吸收随热聚合时间延长而降低，表明SCLA-FAV的自交联度在不断地上升。根据图2A所示的CLA-FAV标准紫外吸收曲线，计算得到的SCLA-FAV在不同热聚合时间下的交联度列于表1，说明热聚合反应20 h后自交联度即接近50%，足以使SCLA-FAV结构稳定，可以用作Pickering乳液的颗粒乳化剂。图2C为该SCLA-FAV的TEM影像，表明其颗粒平均粒径为14 nm左右。

图1 CLA组装及自交联示意图

图2 SCLA-FAV的表征

表1 不同热聚合时间对SCLA-FAV自交联度的影响

2.2 SCLA-FAV稳定的Pickering乳液

自交联后的脂肪酸囊泡具有固体颗粒的性质，可用于稳定Pickering乳液。考虑到自交联度以及时间成本，选取15 h进行热聚合制备SCLA-FAV样品。以橄榄油为油相，SCLA-FAV为乳化剂，经高速均质成乳，并用溶剂稀释法初步判断该乳液为O/W型。24 h后观察乳液的外观，发现其仍然没有发生破乳，一周之后亦如此。这说明以热聚合法制备的SCLA-FAV对橄榄油具有较好的乳化效果。此外，改变O/W比例，当油相体积分数为50%～70%的乳液底部均有水相析出，而当油相体积分数高达75%～80%时则无水相析出且无油相析出(图3)，充分说明所制得的SCLA-FAV可以稳定高内相Pickering乳液，超景深三维显微镜照片显示乳液液滴的平均粒径为(20.0±4.0) μm。

图3 SCLA-FAV稳定的Pickering乳液的外观图

2.3 Pickering乳液包埋白藜芦醇

将白藜芦醇溶于橄榄油(100 mg/L)中成乳后避光保存一天后乳液即发生破乳，转而分别以大豆油、葵花籽油和玉米油替代橄榄油，但均引起破乳。初步判断这是由于白藜芦醇的结构所引起的，白藜芦醇属于天然的多酚化合物(典型分子结构如图4所示)，据报道其易溶于甲醇、乙醇等极性较强的溶剂[9]；而本研究以天然油脂作为油相，其主要组成均是长链饱和/不饱和脂肪酸的甘油三酯，根据相似相容原理，白藜芦醇难溶于其中，从而导致包埋不成功。

图4 白藜芦醇的典型分子结构

β-胡萝卜素在乙醇中的最大吸收波长为450 nm，因此选取在450 nm处测定一系列不同浓度β-胡萝卜素乙醇溶液吸光度，绘制其浓度-吸光度标准曲线，如图5A所示。为了探究橄榄油中β-胡萝卜素浓度对乳液液滴大小的影响，配制不同浓度的β-胡萝卜素的橄榄油溶液，均质乳化后使用超景深三维显微镜观察乳液液滴，统计得平均粒径均分布在(20±4.5) μm，即包埋的β-胡萝卜素浓度较小时对乳液液滴影响并不明显。β-胡萝卜素是一种具有强抗氧化作用的脂溶性生物活性成分，可应用于营养保健品、化妆品和医药等领域，但由于水溶性差、光敏性及热敏性而导致其应用受到一定限制[10]。为了研究SCLA-FAV稳定的Pickering乳液包埋的β-胡萝卜素在紫外辐射下的稳定性，选取浓度为1000 mg/L的β-胡萝卜素的橄榄油溶液作为油相制备Pickering乳液，并将β-胡萝卜素在O/W型Pickering乳液中的保留率及其在橄榄油溶液或在橄榄油和pH 8.60的缓冲液(v/v=3:1)的简单混合液(简称混合液)中的保留率进行对比[11]。图5B即为紫外辐射时间对上述三种环境下β-胡萝卜素保留率的影响，反映了各自降低β-胡萝卜素的降解速度的能力；5 h后，β-胡萝卜素在Pickering乳液、橄榄油以及混合液中的保留率分别为88.40%、71.69%和71.63%。由于橄榄油以及混合液环境下β-胡萝卜素直接面对紫外辐射，导致β-胡萝卜素降解较快；而在乳液体系中，内层油相包埋的β-胡萝卜素分散在水连续相中，油/水界面上的SCLA-FAV颗粒吸附层能够部分屏蔽紫外辐射，对β-胡萝卜素提供了重要的保护作用；而且外水相折射也减弱了紫外辐射对β-胡萝卜素的直接辐射。这与文献中Xiao等[12]报道的以高粱醇溶蛋白颗粒稳定的Pickering乳液包埋姜黄素的效果类似。

图5 β-胡 萝卜素标准曲线(A)以及不同紫外辐射时间对β-胡萝卜素保留率的影响(B)

3 结论

天然小分子脂肪酸CLA经过自组装和自交联后形成脂肪酸囊泡SCLA-FAV，热聚合反应20 h后自交联度即接近50%，平均粒径为14 nm左右。用该SCLA-FAV作为Pickering乳液的颗粒乳化剂，可以稳定O/W型高内相(橄榄油的油相体积分数已大于72%)的Pickering乳液，其乳液液滴的平均粒径为20.0 μm左右。使用SCLA-FAV稳定橄榄油的O/W型Pickering乳液对光-热敏感性的β-胡萝卜素进行包埋，可有效抑制β-胡萝卜素在紫外辐射下的降解速度。因此该新型SCLA-FAV颗粒乳化剂及其稳定的Pickering乳液具有良好的生物安全性，在食品药品化妆品以及个人清洁和护理用品行业中具有明显的优势。