朱丽明 那学武 李海洲

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，好发于40岁以上男性，以声门上型和声门型多见，又以鳞癌为常见组织学类型[1]。目前喉癌的主要治疗手段仍为手术切除，早期喉癌术后患者预后通常较好，5年生存率远高于晚期患者[2]，且早期喉癌可行喉显微激光手术切除，与传统开放手术相比具有创伤小、恢复快、并发症少等优点，患者无病生存率显著上升[3]。而晚期患者通常只能行开放手术或无法手术，患者生存质量明显下降。若能在喉癌早期对其进行诊断和治疗，可以大大提升患者生存质量。近年来研究发现Hippo通路在肿瘤疾病的发生发展中扮演重要角色。Hippo通路最早发现于果蝇体内，具有高度保守的特点，在调控细胞增殖、促进组织再生等生命活动中发挥作用[4]。YAP蛋白是Hippo通路的重要效应器，和其旁系同源TAZ蛋白共同构成Hippo通路的关键转录共刺激分子[5]。YAP、TAZ在肿瘤中过表达促进肿瘤生长、浸润，被认为是多种肿瘤的促癌基因[6]。研究表明多种肿瘤疾病中存在Hippo通路失活及YAP、TAZ高表达[7]，但其在喉癌中作用尚不明确。本研究旨在探讨喉癌中YAP、TAZ的表达水平及临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般资料

收集2012年3月至2015年3月于我院耳鼻咽喉头颈外科就诊的77例喉癌患者手术切除的肿瘤组织和正常癌旁组织。患者中男性66例、女性11例；年龄33岁～76岁，其中≥60岁43例，<60岁34例；声门型57例，声门上型20例；高分化13例，中分化38例，低分化26例；肿瘤直径<2 cm者21例，≥2 cm者56例；有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者53例；根据国际抗癌联合会UICCTNM分期标准(2002)进行分期，Ⅰ、Ⅱ期41例，Ⅲ、Ⅳ期36例。所有肿瘤组织经病理科验证均为鳞癌，患者均为首次发病，未接受化疗、放疗、靶向治疗和生物免疫治疗。本研究所有研究对象均签署对研究的知情同意书并经医院医学伦理委员会审核通过。

1.2 免疫组化法检测组织中蛋白表达

组织蜡块脱蜡水化，修复抗原，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次后滴加H2O2浸泡15 min，PBS冲洗后滴加山羊血清封闭，滴加一抗(YAP、TAZ一抗均购自美国BD生物公司，1∶200稀释)，置于湿盒内4 ℃孵育过夜。次日PBS冲洗3次，室温下滴加二抗孵育1 h，PBS冲洗后DAB显色后苏木精复染，梯度酒精脱水中性树胶封片，镜下观察。

1.3 结果判定

采用双盲法评估结果，细胞质和(或)细胞核染为黄色、棕色或褐色记为阳性，每张切片选择5个高倍镜下视野(×200)，实用半量免疫评分法评价结果。阳性细胞占比：≤10%，记0分；>10%～25%，记1分；>25%～50%，记2分；>50%～75%，记3分；>75%，记4分。染色强度：黄色记1分、棕色记2分、褐色记3分。阳性细胞占比和染色强度相加，0～3分记为低表达，>3分记为高表达。

1.4 统计分析

实验数据使用SPSS21.0软件进行分析，比较蛋白表达差异采用χ2检验，蛋白表达与喉癌临床病理因素的关系采用Fisher’s检验，相关性分析采用Spearman法，采用Kaplan-Meier生存曲线对患者生存情况进行比较，统计结果以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 YAP、TAZ蛋白在喉组织中的表达情况

免疫组化结果显示喉癌组织中YAP蛋白高表达率为85.7%，高于正常癌旁组织的23.4%，差异具有统计学意义(P<0.001)；TAZ蛋白高表达率为81.8%，高于正常癌旁组织的27.3%，差异具有统计学意义(P<0.001)，见表1。

表1 YAP、TAZ蛋白在不同组织的表达情况(例，%)

2.2 YAP、TAZ蛋白表达与喉癌临床因素的关系

患者组织中YAP、TAZ蛋白表达水平与患者年龄、性别和肿瘤解剖位置无关(P>0.05)，与患者肿瘤分期、有无淋巴结转移、肿瘤直径、分化程度相关(P<0.05)，见表2。

表2 YAP、TAZ蛋白表达与临床因素的关系/例

2.3 喉癌组织中YAP、TAZ蛋白的相关性

YAP高表达的66例喉癌患者组织中，有41例同时存在TAZ高表达。Spearman相关分析显示YAP表达与TAZ呈正相关(γ=0.244，P=0.025)。

2.4 YAP、TAZ蛋白与喉癌患者预后的关系

本研究中77例喉癌患者5年随访存活61例，死亡13例，失访3例，5年存活率79.2%。本研究使用总生存时间作为患者的预后指标，所有死亡患者均死于喉癌及并发症，无其他原因导致的患者死亡。66例YAP高表达喉癌患者中存活51例，死亡12例，失访3例；11例YAP低表达喉癌患者中存活10例，死亡1例，无失访。63例TAZ高表达喉癌患者中存活49例，死亡12例，失访2例；14例TAZ低表达喉癌患者中存活12例，死亡1例，失访1例。使用Kaplan-Meier法进行生存分析，结果显示YAP、TAZ高表达患者5年生存率明显低于低表达患者(P<0.05)，见图1。

图1 YAP、TAZ蛋白与喉癌患者预后的关系

3 讨论

喉癌是一种常见的头颈部恶性肿瘤，以鳞癌多发，占所有患者的95%以上。喉癌的发生与多种因素相关，吸烟、饮酒、遗传因素和HPV感染均能导致喉癌的发生[8]。随着医疗技术的发展，肿瘤精准治疗能够大大提升早期喉癌患者的生存率[9]，但对晚期患者治疗效果仍不明显，且晚期喉癌易复发，常需要再行喉全切术，严重降低患者生活质量[10]，而目前还没有监测晚期喉癌患者预后的特异性指标。近年来肿瘤分子标志物的研究受到广泛关注，若发现与喉癌发病及预后相关的分子指标，就能够对喉癌进行早期诊断或有效监测患者预后，有利于喉癌的诊治。

Hippo通路自发现以来被证实存在于多种哺乳动物体内，有研究表明其在调节器官大小、免疫稳态和组织修复等多种生命活动中发挥作用[11]。在肿瘤中Hippo通路常作为抑癌基因调控细胞生长，通过磷酸化途径抑制组织生长速度，调节细胞生长周期[12]。Hippo通路调控生命活动十分依赖其核心效应器YAP/TAZ的转录活性，通常情况下Hippo通路相关激酶抑制了YAP/TAZ的活性，但这种抑制关系在多种肿瘤中被解除[13]。研究表明许多肿瘤疾病中均存在Hippo通路相关基因缺失或表达异常，导致YAP、TAZ的高表达[14]，而YAP/TAZ具有促进细胞增殖、抑制凋亡作用，并在调节肿瘤干细胞发育的过程中扮演重要角色[15]。最近的研究发现，YAP/TAZ还通过调节肿瘤微环境促进肿瘤的生长，结肠癌中YAP能够诱导巨噬细胞像M2表型极化，抑制机体抗肿瘤免疫[16]，而在前列腺癌中YAP/TAZ能够耗竭体内树突状细胞完成免疫逃逸[17]。还有研究表明在乳腺癌中YAP/TAZ能够促进上皮细胞间充质转化，增强肿瘤细胞侵袭能力[18]，而在肝癌、肺癌、结肠癌等恶性肿瘤中YAP/TAZ的高表达常被视作疾病预后不良的指标[19]。本研究发现喉癌患者肿瘤组织中YAP/TAZ表达水平显著高于正常癌旁组织(P<0.001)，可能与喉癌的发病相关，结果与文献报道一致[20]。肿瘤组织中YAP/TAZ表达与患者疾病预后相关(P<0.05)，可能作为监测喉癌预后的相关指标发挥作用。

相关性研究发现喉癌组织中YAP表达与TAZ呈正相关(γ=0.244，P=0.025)，提示YAP/TAZ可能通过联合途径参与喉癌的发生发展。喉癌患者组织中YAP、TAZ蛋白表达水平与患者年龄、性别和肿瘤解剖位置无关(P>0.05)，与患者肿瘤分期、有无淋巴结转移、肿瘤直径、分化程度相关(P<0.05)，提示YAP、TAZ参与了喉癌的侵袭和转移。

综上所述，本研究通过检测喉癌患者组织及癌旁正常组织中YAP、TAZ的表达情况，发现YAP、TAZ与喉癌的发生发展及预后相关，提示YAP、TAZ的表达能够在监测患者预后中发挥作用。YAP和TAZ在喉癌组织中表达强度具有相关性，但二者在喉癌中的作用机制仍需进一步研究。