朱四红 谭布珍 胡 辉 陈庚发

卵巢癌是全球女性癌症死亡原因的第5位[1]，其预后与基础病变、转移途径和化疗的耐药性密切相关。目前卵巢癌的标准治疗是肿瘤减灭术和以铂类药物为基础的化疗方案，但卵巢癌耐药问题日趋严重，患者多因耐药而导致治疗失败和肿瘤复发[2-3]。雷公藤内酯醇(triptolide，TP)是从雷公藤中分离到的二萜内酯化合物，具有多效抗癌活性。已有大量实验研究证实，雷公藤内酯醇对各种癌症细胞及动物模型具有一定的抗癌作用[4-6]，其机制主要与抑制肿瘤细胞的增殖和诱导多种肿瘤的凋亡有关。

本课题组前期通过一系列体内外实验观察了雷公藤内酯醇对卵巢癌细胞具有明显的杀伤和促凋亡作用，其机制可能与上调Caspase-3和Caspase-7的表达、下调PIK3、p-Akt、p-GSK3β、MMP2、Sorcin、VEGF的表达，阻滞细胞周期、抑制PIK3/AKT/GSK3β信号通路和NF-kB转录等有关。本课题拟进一步探索雷公藤内酯醇是否通过抑制HIF-1α信号通路，进而导致MMP2、Sorcin、VEGF表达下降，促进细胞凋亡，并逆转卵巢癌细胞耐药。

1 材料与方法

1.1 材料

雷公藤内酯醇购自Solarbio公司；SKOV3和SKOV3/DDP细胞购自中国科学院上海细胞库；一抗鼠源GAPDH抗体购自proteintech公司；一抗兔抗Scorin、MMP2和VEGF蛋白单克隆抗体购自Abcam公司；二抗山羊抗兔和山羊抗鼠、普通敏化学发光试剂盒购自北京全式金公司；TUNEL检测试剂盒、RIPA裂解液(强)购自碧云天公司；Western及IP裂解液购自北京普利莱公司；胰蛋白酶、Tween20购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)购自HyClone公司；超敏化学发光试剂盒、蛋白Marker、Western膜再生液购自美国赛默飞公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blot实验检测雷公藤内酯醇对HIF-1α蛋白的影响 实验分为2组：SKOV3/DDP细胞组和SKOV3/DDP细胞+TP组。在2组样本加入相应的裂解液中，4 ℃裂解30 min，在10 000 rpm/min离心10 min，小心吸取上清液，即得总蛋白。利用BCA试剂盒进行蛋白浓度测定。蛋白变性、上样、电泳1～2 h，湿法转膜30～50 min。4 ℃孵育一抗溶液过夜；室温孵育二抗1～2 h。在膜上滴加ECL曝光液，曝光。用“Quantity one”软件分析各抗体条带灰度值。

1.2.2 SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒 实验分为2组：SKOV3/DDP细胞组(NC)和转染HIF-1α干扰质粒后的SKOV3/DDP细胞组(shHIF-1α)。将对数生长期的SKOV3/DDP细胞，接种于6孔板；孵育48 h；将脂质体、质粒置于室温，用前混匀；用Opti-MEM将4 μg质粒DNA稀释成250 μl，轻轻混匀；用250 μl Opti-MEM将脂质体LipofectamineTM2000 10 μl稀释，孵育5 min；将稀释的质粒DNA和稀释的脂质体混合，孵育25 min；每孔加入质粒DNA脂质体复合物500 μl，孵育至相应时间，进行相应的检测，每一项实验均重复3次；6 h后，更换完全培养基，中止转染。48 h后，在荧光显微镜下观察SKOV3/DDP细胞转染情况。

1.2.3 Western blot检测细胞转染后HIF-1α、MMP2、Sorcin、VEGF的表达 实验分组同1.2.2。实验方法同1.2.1。

1.2.4 TUNEL观察细胞凋亡情况 实验分组同1.2.2。制片后将组织切片入放入65 °C烤箱中烤2 h；切片在二甲苯放置10 min，更换二甲苯再放置10 min；将切片依次放入100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、80%乙醇和纯化水中各5 min。将切片移入湿盒中，每个样本上滴加 50 μg/ml Proteinase K工作液，37℃反应 30 min。PBS充分洗涤3次，每次5 min。用吸水纸吸掉组织周围的PBS，每张玻片滴加足够量的TUNEL检测液，45 °C避光孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min；用吸水纸吸干玻片上的液体，用抗荧光淬灭封片后，荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法

采用 SPSS 25.0软件分析，计量资料采用t检验。若P<0.05，则认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Western blot检测雷公藤内酯醇对HIF-1α蛋白的影响

Western bolt检测2组细胞中HIF-1α的表达情况，结果示：SKOV3/DDP组中HIF-1α蛋白灰度值为1.057±0.008，SKOV3/DDP+TP组中HIF-1α蛋白灰度值为0.357±0.031。由此可见，与SKOV3/DDP组细胞相比，SKOV3/DDP+TP组的HIF-1α表达明显降低(t=37.96，P<0.05)，见图1。

图1 Western blot检测各组HIF-1α的表达情况

2.2 荧光显微镜观察SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒

SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒48 h后，在荧光倒置显微镜下用蓝光激发，激发波长为480 nm，发射波长为520 nm，可见细胞中出现绿色荧光，表明SKOV3/DDP细胞转染成功，并且能够正常表达其功能(如图2箭头所示所示)。

图2 荧光显微镜下观察SKOV3/DDP细胞转染后的荧光反应

2.3 Western blot检测转染后HIF-1α的表达情况

在SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒后，Western blot检测2组HIF-1α的表达情况，结果示：SKOV3/DDP(NC)组中HIF-1α蛋白灰度值为1.063±0.161；转染HIF-1α干扰质粒后的SKOV3/DDP细胞(shHIF-1α)组中HIF-1α蛋白灰度值为0.223±0.106。由此可见，转染HIF-1α干扰质粒后的SKOV3/DDP细胞的HIF-1α蛋白表达水平显著下降，与对空白对照组相比，差异有统计学意义(t=7.53，P<0.05)，见图3。

图3 SKOV3/DDP细胞转染后HIF-1α的表达情况

2.4 Western blot检测MMP2、Sorcin、VEGF的表达情况

在SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒后，SKOV3/DDP细胞的HIF-1α蛋白表达水平显著下降。Western blot检测2组MMP2、Sorcin、VEGF的表达情况，结果示：①NC组：MMP-2蛋白灰度值为1.032±0.153，Sorcin蛋白灰度值为1.049±0.053，VEGF蛋白灰度值为1.084±0.122。②shHIF-1α组：MMP-2蛋白灰度值为0.246±0.029，Sorcin蛋白灰度值为0.324±0.015，VEGF蛋白灰度值为0.285±0.014。由此可见，在卵巢癌SKOV3/DDP细胞转染后，HIF-1α的表达降低后，MMP2、Sorcin、VEGF的表达均有所下降，差别有统计学意义(P<0.05)(如图4及表1所示)。

图4 2组MMP2、Sorcin、VEGF的表达情况

表1 2组间MMP-2、Sorcin、VEGF 蛋白灰度值的比较

2.5 TUNEL观察转染后细胞凋亡情况

TUNEL观察转染HIF-1α干扰质粒后SKOV3/DDP细胞凋亡情况结果示：SKOV3/DDP组：每个视野细胞凋亡数目为7.33±2.08；SKOV3/DDP+TP组：每个细胞凋亡数目为31.33±3.06。由此可见，在卵巢癌SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒后，降低HIF-1α的表达后，凋亡细胞数目明显增加，差别有统计学意义(t=11.23，P<0.05)，如图5。

图5 TUNEL检测转染HIF-1α干扰质粒后细胞凋亡情况

3 讨论

肿瘤微环境的特点为组织缺氧、酸中毒、间质高压、大量生长因子和蛋白水解酶产生及免疫炎性反应等，其中最典型的就是缺氧和酸中毒[7-8]。肿瘤细胞需要上调缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)，激活细胞增殖，促进血管新生和下调细胞凋亡水平，使其在缺氧条件下能继续存活并增殖[9-11]。

HIF1-α是介导细胞低氧反应的关键核转录因子，参与肿瘤细胞增殖、侵袭和转移的调控，对卵巢癌多药耐药的形成起到多方面作用[12-13]。HIF-1α在多种恶性肿瘤中过表达，如卵巢癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌等，作为肿瘤组织低氧性适应中的关键因子，其已成为恶性肿瘤治疗研究的重要靶点之一[14-15]。多项实验研究证实低氧环境所诱导的HIF-1与卵巢癌发生、发展关系密切，其机制可能与促进MMP2、Sorcin、VEGF表达增高有关[16-18]。监测肿瘤组织中HIF1-a和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表达率，能辅助早期诊断卵巢癌并预测其侵袭性[19]。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)是一类参与多种组织细胞外基质降解的蛋白酶家族，其中基质金属蛋白酶MMP-2在肿瘤的血管化、肿瘤细胞的侵袭和转移的形成中均起着重要作用。可溶性耐药相关钙结合蛋白基因(Soluble resistance-associated calcium-blinding protein，Sorcin)是一种可溶性耐药相关钙结合蛋白，与癌细胞的多药耐药有关。HIF-1还可介导内皮素-1、P-gp上调而促进卵巢癌细胞播散和侵袭[20-22]。研究[23-25]发现沉默或下调人卵巢癌细胞的HIF-1α表达后，能抑制卵巢癌多药耐药，并可增加其对顺铂的敏感性。

本实验中，SKOV3/DDP+TP组的HIF-1α表达明显降低，SKOV3/DDP细胞转染HIF-1α干扰质粒，降低了HIF-1α的表达，且MMP2、Sorcin、VEGF的表达均有所下降，且细胞凋亡数目显著增加。由此推测，雷公藤内酯醇可降低HIF-1α的表达，并通过抑制HIF-1α信号通路，进而导致MMP2、Sorcin、VEGF蛋白的表达下降，促进细胞凋亡，从而逆转卵巢癌细胞的耐药性，增加其对顺铂的敏感性。本研究将为雷公藤内酯醇成为新的化疗药物，或作为化疗增敏剂与传统化疗药物联合应用治疗难治性或耐药性卵巢癌提供重要的实验依据。