王新征 侯永强 汲权威

化疗是控制肿瘤的有效方法，但多药耐药(MDR)是化疗失败的重要原因。目前，寻找积极的措施逆转肿瘤多药耐药迫在眉睫。抗疟新药咯萘啶(PND)是1种逆转肿瘤耐药的新药，其是否具有逆转肿瘤耐药的作用尚在研究。本研究选择人乳腺癌细胞系MCF-7和其耐药细胞MCF-7/ADM建立裸鼠荷人肿瘤耐药和敏感细胞移植瘤模型，以评估抗疟新药咯萘啶(pyronaridine，PND)的逆转肿瘤MDR的体内作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物和试剂 RPMI 1640培养基，Gibco产品：胎牛血清，中国医学科学院血研所生产；注射用盐酸阿霉素；注射用顺铂；注射用磷酸咯萘啶，由天津药物研究院；实验所用药均以无菌蒸馏水配成相应浓度备用。

1.1.2 细胞系与细胞培养 乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/ADM；常规传代培养。

1.1.3 实验动物 alb/c裸鼠(nu/nu)，雌性，5.7周龄，体重16～229，购自中国生物制品鉴定所动物中心。

1.1.4 实验仪器 紫外分光光度计UV-3000型、高压液相色谱仪Waters510；酶标仪Microplate Reader450；流式细胞仪；激光光密度扫描仪；高速台式离心机TGL-16c；低温离心机。

1.2 实验操作

1.2.1 裸鼠移植瘤单侧模型的建立 采用人耐药细胞MCF-7/ADM和乳腺细胞系MCF-7接种于裸鼠上，建立耐药单侧和肿瘤敏感模型。接种位置在右侧前肢根部背侧，单只小鼠接种细胞数量为0.2 ml，肿瘤以每6～9天100～300 mm3的速度生长，随机分组，各组为6只小鼠。

1.2.2 体内抗耐药肿瘤活性试验 分组为3组：对照组A组、对照组B组、观察组。A组注射相应溶剂；B组注射阿霉素；观察组注射不同剂量的PND，高剂量∶中剂量∶低剂量=4∶2∶1。耐药移植肿瘤接种后第9天开始给药，移植肿瘤接种后第6天开始给药，每隔3天给药1次，腹腔注射。

1.3 评价标准

裸小鼠移植瘤模型使用游标卡尺测量肿瘤直径，观察抗肿瘤疗效，每3天测量一次肿瘤直径。

2 结果

2.1 肿瘤动物模型建立结果

2.1.1 MCF-7/ADM裸鼠移植瘤的生长特性 观察MCF-7/ADM敏感细胞接种后第6天的生长状况，对体积>100 mm3的成瘤进行收集；在MCF-7/ADM耐药细胞接种后第9天进行收集。随着时间的延长，肿瘤体积增大，并且耐药肿瘤和敏感肿瘤的生长速度相当，无明显差异。

2.1.2 裸鼠移植瘤对ADM的耐药特性 在无菌条件下，取裸鼠肿瘤组织制作单细胞悬液，评估MCF-7/ADM裸鼠移植瘤对阿霉素的耐药作用，裸鼠移植瘤MCF-7/ADM细胞ICSO达到180.5 pg/ml，耐药倍数达到56倍，和体外培养的原代细胞对比，裸鼠移植瘤MCF-7/ADM细胞耐药倍数下降，但是耐药特性良好。

2.2 PND联合ADM裸鼠移植瘤生长的抑制和对裸鼠体重的影响

与对照组B组对比，低剂量和中剂量联合组抑瘤率无明显差异，P>0.05；高剂量联合组抑瘤率明显更高，数据差异显著，P<0.05。见表1。对照组A组和低剂量(1 mg/kg)联合组的体重无显著差异，P>0.05；和对照组A组对比，中剂量(2 mg/kg)联合组、高剂量(4 mg/kg)联合组和对照组B组明显降低，数据差异显著，P<0.05；和对照组B组对比，高剂量(4 mg/kg)联合组治疗后小鼠体重明显降低，数据差异显著，P<0.05。见表2。

表1 PND联合ADM对裸鼠移植瘤生长的抑制的影响

表2 PND联合ADM对裸鼠体重的影响

3 讨论

3.1 肿瘤细胞耐药机制

肿瘤细胞对化疗药物产生耐药的主要机制在于以下几点[1-8]：其一，耐药药理，主要是由于机体对于药物的反应所导致的，当药物进入人体时，由于代谢提高导致药物在体内的穿透力较差，所以导致细胞外的药物浓度较低。其二，细胞耐药，由肿瘤细胞的遗传特点、生化特点所致，导致细胞对药物产生耐药，可通过细胞膜-核膜蛋白-药物输出的途径，导致细胞内药物排出细胞外，导致细胞内的药物浓度降低；也可通过细胞质/核内蛋白的途径，促使药物靶酶质和量都改变，例如降低DNA拓扑异构酶含量及活性，增强06-甲基鸟嘌岭-DNA甲基转移酶活性，增强DNA修复功能。其三，凋亡耐药，抗肿瘤药物需通过细胞凋亡促使肿瘤细胞死亡，促凋亡基因丧失对肿瘤细胞耐药的产生起着一定的作用。由此可见，肿瘤耐药影响因素来自于多方面，随着诱导药物、癌细胞的微环境及类型变化而表现出不同的耐药表型。相关研究证明[9-10]，因为体内毒性浓度不及体外的有效逆转浓度，多数肿瘤耐药逆转药物虽然可在血液肿瘤中发挥着一定的效果，但是应用于实体瘤中效果欠佳。目前，世界上尚无一种耐药逆转剂纳入临床公认的逆转肿瘤耐药剂，必须开发新的肿瘤耐药逆转剂。

3.2 PND联合ADM对裸鼠移植瘤生长的抑制

在评估肿瘤耐药逆转剂的作用中，体内抗肿瘤试验结果是重要的指标之一。本研究选取人乳腺癌细胞系MCF-7和其耐药细胞MCF-7/ADM建立模型，并且以此评估PND在体内的逆转肿瘤MDR作用。根据ADM和PND各自的药物代谢动力学特点和最大耐受量，研究显示不同剂量ADM+PND联合治疗组对MCF-7/ADM移植瘤的肿瘤生长具有明显差异。与对照组B组对比，低剂量和中剂量联合组抑瘤率无明显差异，P>0.05；高剂量联合组抑瘤率明显更高，数据差异显著，P<0.05。提示PND具有明显的体内逆转肿瘤耐药作用。

3.3 PND联合ADM对裸鼠体重的影响

在观察抗肿瘤药物的疗效同时，也必须观察PND抗肿瘤治疗的毒性，通过观察治疗后裸鼠的体重变化可间接体现出药物的毒性作用[11]，结果表明，和对照组A组对比，中剂量(2 mg/kg)联合组、高剂量(4 mg/kg)联合组和对照组B组明显降低，数据差异显著，P<0.05；和对照组B组对比，高剂量(4 mg/kg)联合组治疗后小鼠体重明显降低，数据差异显著，P<0.05。

但大多数能够耐受，停药后小鼠体重不再继续下降，结果提示裸鼠的体重下降与药物相关，联合高剂量的ADM和PND能够提高疗效，但同时也增加了毒性。

综上所述，PND具有高效的逆转肿瘤MDR的作用，可作为一种新的肿瘤耐药逆转剂。