赫 卫 张 慧

（1 贵州中医药大学药学院，贵州贵阳 550025；2 黑龙江省农业科学院园艺分院，黑龙江哈尔滨 150069）

辣椒疫霉菌（Phytophthora capsiciL.）是辣椒生产中极具破坏力的病原体，发病严重时可导致辣椒减产50%以上，甚至绝收。辣椒疫病发病范围广，生理小种繁多，病原菌极易发生变异，从而导致耐药菌株的产生（Pennisi &Agosteo，1998；罗赫荣 等，1999；谢丙炎和吴新平，2000；Oelke et al.，2003），而抗病育种是防治此病害的主要手段之一。但由于缺乏广泛适用的抗疫病辣椒资源，且辣椒抗疫病遗传规律复杂，抗病机制不清晰，导致当前育种成果进展缓慢。因此，辣椒疫病抗性机制已成为目前研究的重点。本文着重阐述了宿主和病原体的分子机制研究进展，为研究辣椒-疫霉菌病理提供理论指导。

1 辣椒疫病抗性基因

1.1 辣椒疫病抗性基因的定位

辣椒疫霉菌抗性来源的遗传方式有：单基因遗传、寡基因遗传和多基因遗传。有研究表明，单显性基因或具有修饰基因的单显性基因可调控辣椒对疫霉菌的抗性（Saini &Sharma，1978；Barksdale et al.，1984；Kim &Hur，1990）。在寡基因遗传方面，前人研究表明，在辣椒材料CM334 中至少两个基因共有抗性（Reifschneider et al.，1986，1992；Ortega et al.，1991，1992；Walker &Bosland，1999；Thabuis et al.，2003；Sy et al.，2005）。有研究认为，疫病的抗性是指具有基于多峰分布和更高阶上位效应的多基因遗传性（Bartual et al.，1991，1993；Pflieger et al.，2001；Lefebvre et al.，2002；Ogundiwin et al.，2005；Toru et al.，2006；Bonnet et al.，2007）。目前，已鉴定出一些与辣椒疫霉菌抗性相关的数量性状基因座（QTL）（Thabuis et al.，2004a；Ogundiwin et al.，2005；安静等，2007；Minamiyama et al.，2007；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Naegele &Hausbeck，2014）。

辣椒第5 号染色体是疫病抗性的主要定位区间。Quirin 等（2005）在辣椒第5 号染色体上定位了1 个与Phyto.5.2紧密相连的基因座。Kim 等（2008）找到了2 个QTLs，位于辣椒第5 号染色体上的RFLP 标记CDI25 和第9 号染色体上的CT211A 标记附近。Lu 等（2012）检测到LG5 的a035_1 和a170_1 之间的一段连续区间是主要效应位点，并且考虑到上位性效应，这些QTL 可以解释高达98.25%的抗性表型变异。Mallard 等（2013）确定了1 个主要的QTL，Pc5.1，位于辣椒第5 号染色体上，与来自不同地理区域的12 种疫霉菌的分离株抗性相关。Liu 等（2014）使用基因芯片对辣椒第5 号染色体上的主效QTL 进行分析，发现Phyto5SAR 标记位于主效QTL 区间，Phyto5SAR标记的支架序列（scaffold194）包含2 个疫病抗性候选基因，推测为NBS-LRR基因和SAR8.2A基因。Wang 等（2016）将辣椒疫病抗性基因定位到第5 号染色体的区间上，仅3.3 cM，鉴定出2 个候选基因Capana05g000764和Capana05g000769。Siddique 等（2019）应用GWAS 在整个辣椒基因组中检测到117 个与辣椒疫病抗性相关的重要SNP，并将对辣椒疫霉菌的分离株具有广谱抗性的3 个主要影响基因座（5.1、5.2 和5.3）定位到辣椒第5 号染色体上。Kim 等（2019）分析了辣椒第5 号染色体上的主要QTL 区（6.2～139.2 Mb），鉴定出候选抗性基因类似物（RGA），包括14 个核苷酸结合位点富含亮氨酸的重复序列，3 个受体样激酶和1 个受体样蛋白。这些研究为辣椒疫病抗性的基因筛选和标记开发提供了良好的基础。

目前，已有大量研究报道了辣椒中的QTL可转化为分子标记，从而进行更快速的育种选择（Quirin et al.，2005；Kim et al.，2008；Truong et al.，2012；Chomkaeo et al.，2014；Wang et al.，2016；Xu et al.，2016）。辣椒第5 号染色体因被多次确定为QTL 位点而备受重视，并开发了分子标记。例如，标记Phyto5NBS1可解释高达90%的遗传变异（Liu et al.，2014），标记CaNB-5480 最高分离率为86.9%（Kim et al.，2019）。然而，迄今为止，这些公开获得的分子标记通常不能被广泛应用，且已经观察到一些分子标记在应用于多种种质中会出现一定程度的表型和基因型不匹配，这种不匹配限制了标记辅助选择育种的发展。此外，多标记结合使用可以提高标记的利用效率。例如CaNB-5480、CaRP-5130 和CaNB-5330 3 个标记结合，可提高61 个辣椒品种的基因分型准确性（Kim et al.，2019）。

1.2 辣椒疫病抗性相关基因的鉴定

目前已通过多种方法获得辣椒疫病抗性基因，但检测到的基因仍然是有限的。有研究者通过标记定位鉴定了可能的抗性基因（Silvar et al.，2008；Zhang et al.，2013；Rehrig et al.，2014；Xu et al.，2016），一些抗性基因在QTL 位点Pc5.1内，且非常接近Pc5.1，包括CaPhyto（Wang et al.，2016）、CaDMR1（Rehrig et al.，2014）以及其他可能的基因（Liu et al.，2014）；通过DDRT-PCR 和cDNAAFLP 等技术筛选出疫霉菌诱导处理后差异表达的基因，包括β-1，3-葡萄糖聚糖酶基因（Catalina et al.，1999）、磷脂酰肌醇/磷脂酰甘油转化蛋白基因（王永成 等，2008）、辣椒叶绿素a/b 结合蛋白基因（林明 等，2007）等。Zhang 等（2013）利用同源克隆方法获得辣椒CaRGA2基因，辣椒接种疫霉菌24 h 时，该基因在抗病品种CM334 中的表达量是感病品种的5 倍，被病毒诱导沉默后，抗病品种对疫病的抗性也受到了抑制。

有些基因家族已参与到辣椒对疫霉菌的防御反应中。例如，SBP-box（Squamosa-promoter 结合蛋白）是一种植物特异性转录因子，利用病毒诱导的基因沉默技术筛选出与疫霉菌防御反应相关的基因CaSBP08、CaSBP11、CaSBP12和CaSBP13。其中，CaSBP08的功能在对疫霉菌的感染防御反应中得到了确认（Zhang et al.，2020）；CaSBP12过表达的烟草植株更容易受到疫霉菌感染，而CaSBP12沉默增强了对疫霉菌感染的防御反应（Zhang et al.，2018），防御相关基因（NbPR1a、NbPR1b、CaPO1、CaSAR8.2、CaBPR1和CaDEF1）的 表达受到不同程度的抑制或诱导，这些结果表明CaSBP12基因负调节了对疫霉菌感染的防御反应。CBL-CIPK 网络参与了胁迫反应，在辣椒基因组中鉴定出9 个CaCBL（钙调神经磷酸酶B 样蛋白）和26 个CaCIPK（蛋白激酶）基因，当植物受到疫霉菌胁迫时，大多数CaCBL 和CaCIPK 基因的表达发生了改变（Ma et al.，2019）。此外，几丁质酶家族的许多成员参与了植物免疫，其中CaChiIV1和ChiIV3的表达受辣椒疫霉菌感染的调节，CaChiIV1沉默的辣椒植株显示出对疫霉菌感染敏感性的增加，因此显示其在特定条件下的共调节作用（Ali et al.，2019）。ChiIV3是植物细胞死亡的正向调节剂，可触发针对辣椒疫霉菌的防御信号和致病相关基因的上调（Liu et al.，2017）。

辣椒中似乎有几种不同类型的R基因，其中大多数R基因是核苷酸结合和富含亮氨酸的重复蛋白（NLR）。辣椒中NLR 基因的大规模扩增，很大程度上是由于长末端重复逆转座子介导的逆转录重复的结果（Kim et al.，2017）。乙烯响应因子在植物对生物胁迫的响应中起着至关重要的作用，如CaPTI1通过病毒诱导基因沉默降低了防御相关基因CaPR1、CaDEF1和CaSAR82的表达以及根系活性来显著削弱防御反应（Jin et al.，2015），CaAP2/ERF064可以通过调节植物中PR 基因的转录来积极调节辣椒的抗性反应（Jin et al.，2019）。多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（PGIP）是具有对真菌产生的许多多聚半乳糖醛酸酶的识别能力的细胞外植物蛋白（de Lorenzo et al.，2001），研究表明金黄色葡萄球菌多半乳糖醛酸酶抑制蛋白1 基因（CaPGIP1）可降低转基因烟草植物的敏感性（Wang et al.，2013）。Jones 等（2015）对XEGIP 基因进行建模以抑制辣椒疫霉菌产生的木葡聚糖特异性内切β-1，4 葡聚糖酶，并攻击植物细胞壁中的木葡聚糖键（Yoshizawa et al.，2012）。一些非典型的广谱基因参与到对辣椒疫霉菌感染的防御反应中，包括CaPIP1-1（Yin et al.，2015）、VpRPW8s（Lai et al.，2018）等。这些基因在辣椒抵抗疫霉菌感染的防御机制中起着重要作用，为辣椒疫病抗性的分子解剖奠定了基础。

1.3 辣椒疫病抗性基因网络

尽管赋予辣椒疫病抗性的基因大部分定位在辣椒第5 号染色体上（Mallard et al.，2013；Kim et al.，2017），但尚未鉴定出在广泛地理区域或不同遗传背景下均具有抗性的基因座。辣椒对疫霉菌的抗性是高度复杂的性状，可能有大量变异导致抗性（Kim et al.，2017）。常见的SNP 分布在整个基因组中，其影响低于可检测的显著性水平，但占复杂性状遗传力的很大一部分（Yang et al.，2010）。而且，复杂的性状在很大程度上受非编码变体（如启动子或增强子）的影响（Boyle et al.，2017），许多重要的基因座通常作用较小。因此，Boyle 等（2017）提出了一种全能模型，该模型假设大多数遗传力可以通过对核心疾病相关途径之外的基因的影响来解释。他们认为，至少在一个组织中具有致病性的任何具有调节变异的基因，基本上都可能对抗病性产生重要影响。因此，疫病抗性基因很可能是一个互相影响的基因网络。

通过全基因组关联研究，对复杂性状遗传基础的理解已大大扩展。Richins 等（2010）确定了在接种辣椒疫霉菌条件下的168 个相关差异表达的基因。以2014 年测序完成的辣椒全基因组作为参考基因组，为辣椒疫霉菌抗性基因表达研究提供了重要借鉴。Wang 等（2015）采用了RNA-seq 技术对辣椒疫病侵染前后的根部差异基因进行分析，遗憾的是只对侵染后的单一时间点进行了分析。Li 等（2020）同样采用RNA-Seq 方法阐明了在感染辣椒疫霉菌后多时间点的根部差异基因，推断苯丙烷类生物合成途径，尤其是其分支衍生的肉桂醛和木质素，在辣椒根部对疫霉菌的抗性中起重要作用。但是，这些基因识别病原相关分子模式（PAMPs）的能力尚不清楚。

2 疫霉菌致病机制

2.1 疫霉菌的致病基因

疫霉菌病原体代表了一种独特的进化谱系，其中致病性已独立获得，因此，迫切需要了解并破坏驱动感染的进程。目前很少受到关注的一个领域是感染期间疫霉菌基因表达的调节。基因表达不仅调节疫霉菌的外观形态，更影响着疫霉菌的毒力。Safdar 等（2017）构建了含有辣椒疫霉菌LRR 功能域的一种酶PcLRR-RK1 的沉默转化子，转化子改变了疫霉菌的孢子囊形状、大小，降低了孢子囊与游动孢子的产量，同时影响了孢子囊萌发及穿透寄主组织细胞的能力，从而导致辣椒疫霉菌毒力降低。疫霉菌中编码坏死和乙烯诱导肽1 类似蛋白（NLPs）的基因家族，又称NPP，是一组疫霉菌分泌的毒素，代表了一类坏死激发子，能够引发许多双子叶植物防御反应和细胞死亡（Fellbrich et al.，2002；Qutob et al.，2002；Bailey et al.，2005）。Ottmann 等（2009）观察到NLP 的晶体结构与海洋生物产生的细胞溶解毒素表现出结构相似性，表明该蛋白通过质膜破坏和细胞溶解作用促进了宿主感染。Feng 等（2011）发现从中国分离出的高毒力辣椒疫霉菌SD33 中存在NLP，进一步研究发现NLP 在辣椒的病症发展中起重要作用（Feng &Li，2013；Feng et al.，2014）。有研究表明，8 个选定的NLP 基因在辣椒疫霉菌的发育和植物感染阶段差异表达，对10 个克隆的NLP 的功能分析表明，Pc11951、Pc107869、Pc109174和Pc118548能够诱导辣椒中的细胞死亡（Chen et al.，2018）。Fu等（2015）确定了疫霉菌中的果胶酸裂解酶基因家族的几个诱导细胞死亡的成员，这些成员在感染过程中被高度诱导，与疫霉菌的毒力相关，并且可能是效应子。病原体甚至与宿主植物构成蛋白复合体以致病，辣椒疫霉菌的抑素PcINF1 与辣椒SRC2-1构成膜靶向PcINF1-SRC2-1 复合物，触发了辣椒植株的细胞死亡，是PcINF1 诱导的辣椒免疫所必需的（Liu et al.，2015）。上述研究概述了辣椒疫霉菌的致病基因，为进一步阐明这种破坏性病原体的致病机理奠定了基础。

2.2 疫霉菌的效应子

疫霉菌可以分泌大量不同毒性或无毒因子到植物中，从而操控植物的生理生化过程，这些因子即效应子。效应子编码被抗病宿主识别的病原体相关分子模式/微生物相关分子模式（PAMPs/MAMPs），并触发模式触发免疫（PTI）。辣椒疫霉菌已经进化出多种多样的分泌效应子，可以抑制PTI 并引发效应触发易感性（ETS）（Jones &Dangl，2006；Hein et al.，2009；Gill et al.，2015）。这些效应子操纵宿主的过程可以创造有利于病原菌定殖的环境。在感病植物中，效应子通过多种机制抑制植物的防卫反应从而增加感病植物的感病性；抗病植物中的抗病基因产物识别效应子，引发抗病植物的过敏性细胞坏死和有效的防卫反应（Kamoun，2003）。

Stam 等（2013）利用辣椒疫霉菌参考基因组，确定了病原体效应子。辣椒疫霉菌产生的几种效应子，例如RXLR、CRN 类的效应子，被认为在辣椒的感病过程中起重要作用。在辣椒疫霉菌基因组中已经鉴定出超过400种候选RXLP效应子（Lamour et al.，2012；Stamet al.，2013）。如辣椒疫霉菌RXLR 效应子PcAvr3a12，通过靶向和抑制新型内质网定位的肽基脯氨酰顺反异构酶FKBP15-2 来促进感染（Fan et al.，2018）。CRN 效应子是卵菌中除RxLR 效应子外的一种重要的胞质效应子，通过保守基序LxLFLAK 检索辣椒疫霉菌全基因组，鉴定CRN 效应子84 个（Stam et al.，2013）。保守的CRN 效应子家族具有引发寄主植物产生防御反应，诱导植物叶片皱缩和坏死的能力（Schornack et al.，2010）。这种诱导宿主细胞死亡的能力可以和毒力功能分开（Amaro et al.，2018）。瞬时表达PcCRN4增强了烟草上的致病疫霉菌毒力；沉默基因PcCRN4显著降低该基因毒力，烟草的病程相关基因PR1b被显著诱导，有大量的胼胝质沉积，表明CRN 具有引发植物防御反应的能力（Mafurah et al.，2015）。PcNMRAL1 是一种转录调节因子，调节辣椒疫霉菌中大量效应子的表达，可介导生物体向坏死体的转化，可能会驱动植物疫病周期（Pham et al.，2018）。疫霉菌基因组包含5 个推定的脯氨酰4-羟基酶（P4Hs），在菌丝体中，所有P4Hs 均响应缺氧而下调，但PcP4H1的表达受影响最大，感染植株时Pc4H1被上调了110 倍以上，Pc4H5被上调了7 倍，而其他P4H 的表达则保持不变（Song et al.，2019）。

Reeves 等（2013）从新墨西哥辣椒品种NMCA10399 中鉴定了辣椒疫霉菌含有抗性基因抑制剂（Ipcr）基因，表明1 个单显性基因抑制了多基因宿主对疫霉菌多个分离株的抗性，并且这个单显性基因对所有病症的抗性都有抑制。辣椒种群中Ipcr基因的作用方式尚不清楚。Ipcr基因的宿主始终是完全易感的，因而增加了鉴定效应子靶标的难度。

3 展望

前人相关研究表明，很难将辣椒疫病抗性引入适应性强的易感品种中，回交时抗性低于供体亲本，这很可能是由于微效抗性基因的缺失（Palloix et al.，1990）。轮回选择已被用于将多基因抗性转移到优良材料中（Thabuis et al.，2004b）。然而，抗性基因与低产量、小果实及较弱的植株等相关基因连锁，是广泛采用抗性品种的主要限制。以分子生物学为基础，应用于疫病抗性相关基因的研究，已成为解决常规育种问题的有效手段。发掘新基因无论是对于深入了解抗病的分子机制还是为基因研究做准备，都具有较大的研究价值。目前对辣椒疫病抗性相关基因表达、分子标记、遗传图谱、QTL定位、同源克隆等研究均取得了重要进展（Kim et al.，2008；Liu et al.，2014）。但对涉及疫病相关基因网络缺乏研究，且其抗性分子机理也不清楚。随着生物学技术手段的不断发展，辣椒疫病抗性分子机理的研究将更加深入。