田永静，孙甜甜，皮宇松，孙康，郝双玲

1. 苏州科技大学环境科学与工程学院，苏州 215009 2. 苏州同科工程咨询有限公司，苏州 215009 3. 济南市市政工程设计研究院(集团)有限责任公司徐州分公司，徐州 221000

由于社会经济快速发展和城市扩张，大量重金属由于人为活动输入环境水体，许多发展中国家的水环境受到威胁[1]。水环境中的重金属不仅会对水生生物造成直接的负面效应，同时可在微生物作用下转化为毒性更高的重金属形态，沿着食物链进行富集、放大[2]，最终对人类健康带来潜在的威胁[3]。在中国近20年各种重金属的年产量中，锌居于首位，锌的高产量和高消费量导致水环境中锌的高暴露量[4]。锌是浮游植物生长所必需的营养元素，在水环境中通常以二价离子的形式存在。此外，锌是碳酸酐酶、超氧化物歧化酶和RNA聚合酶等机体酶的辅基。然而环境中锌含量过高时，就会导致水生生物产生氧化应激反应，细胞形态发生变化，生长受到抑制，甚至死亡[5]。此外，随着环境分析技术的发展，双酚A(bisphenol A, BPA)由于检出频率高且检测浓度高引起了国内外学者的广泛关注，成为当前生态环境中重要的内分泌干扰物(endocrine disturbing chemicals, EDCs)之一[6-8]。EDCs是一类重要的化学物质，它通过干扰内源激素的合成、释放、运输、结合代谢，在极低浓度下模拟或阻断动物体和人体的内分泌功能及其他生理过程[9]。大量动物试验数据[8,10-12]。表明BPA具有雌激素作用，低浓度摄取就会对生物体内分泌系统造成损害，因此许多国家开始禁止BPA用于婴幼儿奶瓶。然而，BPA在其他产品中的广泛和不受管制的使用，导致仍有大量BPA通过生产制造过程中的直接排放、城市污水的排放和工业制成品的溶出等方式进入环境[13]。由于生物体无法将重金属和环境激素完全吸收，加之传统的常规废水处理工艺也无法将其彻底去除，导致水环境中往往存在重金属与环境激素以不同形式及浓度组成的复杂体系，产生的复合效应对生态环境和人体健康造成潜在威胁。

本文以普通小球藻为受试生物，开展重金属锌与环境激素BPA单一及复合暴露对普通小球藻急性毒性、叶绿素含量及生理生化过程的影响，为重金属、环境激素类污染物生物毒性和复合污染的生态风险评价和控制提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料及培养条件

实验用无砷锌粒为银灰色金属颗粒，粒径为20～30目，购自上海美兴化工股份有限公司。BPA分子式为C15H16O2，纯度>99.8%，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。普通小球藻(Chlorellavulgaris)编号FACHB-8，由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供，采用BG11培养基培养，放置于恒温光照培养箱中，培养温度25 ℃，光照条件1 000～2 000 lx，时间设置12 h昼/12 h夜，每天按时摇动3次，并调换各锥形瓶在培养箱中位置，以保证CO2的充分交换、藻细胞悬浮生长及受光均匀。

1.2 实验设计及方法

1.2.1 锌及BPA对小球藻的毒性试验

为准确研究锌含量对普通小球藻生长及生理指标的影响，毒性试验中所用BG11营养液均不含原有成分ZnSO4·7H2O。锌标准溶液的配制方法为溶于适量0.2 mol·L-1的HCl溶液，搅拌至完全溶解后移入容量瓶中，并以灭菌后BG11营养液稀释至标线；BPA标准溶液的配制方法为溶于适量0.2 mol·L-1的NaOH溶液，后续操作与锌标准溶液配制方法相同。

将普通小球藻扩培至对数生长期，并接种至BG11培养基中，试验初始藻细胞密度约1.0×106个·mL-1。根据预实验结果，设置锌、BPA单一暴露浓度如表1所示。联合毒性试验是根据单一毒性试验结果，以锌和BPA对小球藻急性毒性7 d-EC50值为一个毒性单位，采用等毒性配比法(毒性1∶1)，将锌与BPA按一定的混合比例以等对数间距设置7个不同的试验浓度。每组3个平行，同时设空白对照组。

在0、1、2、3、4、5和7 d时取样，测定不同浓度锌、BPA单一及复合暴露条件下微藻的光密度值及叶绿素含量。小球藻在污染物溶液中暴露接触7 d后，进行可溶性蛋白含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性及丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量的测定。

1.2.2 藻密度和叶绿素含量的测定

将培养至稳定期的普通小球藻稀释至不同倍数，使用血球计数板在显微镜下确定藻密度，同时采用紫外分光光度法，在波长685 nm条件下测定对应的吸光度值，建立藻密度(y, 106cells·mL-1)与吸光度(x)的标准曲线为y=30.68x-0.056(可决系数R2=0.998)。按设定时间取样3 mL，测定685 nm波长下各暴露组藻液光密度值。

表1 锌、双酚A单一及复合暴露的试验设计Table 1 Design of single and compound exposure groups of zinc and bisphenol A

通过浮游植物分类荧光仪PHYTO-PAM(泽泉科技有限公司)，按时测定微藻在污染物中暴露不同时间的叶绿素含量。

1.2.3 小球藻生理特性指标的测定

在测定普通小球藻的可溶性蛋白含量、SOD活性及MDA含量前，需收集藻液并对藻细胞进行破碎，具体操作为：首先取25 mL藻液离心，温度4 ℃，转速10 000 r·min-1，离心10 min；倒掉上清液后加入5 mL磷酸缓冲溶液，通过漩涡混匀器使藻液重悬浮；利用超声波细胞粉碎机在冰浴条件下对藻细胞进行破碎，功率300 W，开5 s停15 s，总工作时间10 min，收集到的细胞破碎液用于SOD活性和MDA含量的测定；之后进行第2次离心，温度4 ℃，转速10 000 r·min-1，离心10 min，获取上清液用于小球藻可溶性蛋白含量的测定。

可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法，以牛血清蛋白制作标线；SOD活性采用羟胺法测定；MDA含量的测定采用硫代巴比妥酸(thibabituric acid, TBA)法测定。SOD活性和MDA含量的具体测定方法参照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书。

1.3 数据处理

所有实验均重复3次，通过Origin 9.1求出以比生长率为基础的抑制率与污染物浓度的对数值之间的回归方程，采用直线内插法确定不同污染物的EC50值。采用相加指数法(AI)评价锌与BPA的联合作用类型，具体为：首先通过公式S=Am/Ai+Bm/Bi，求得联合毒性S值(其中m和i分别代表污染物质A和B的联合毒性EC50与单一毒性EC50值)。若S≤1，则AI=1/S-1；若S>1，则AI=S×(-1)+1。用AI值判断联合毒性作用，当AI=0时为毒性相加作用；AI<0时为拮抗作用；AI>0时为协同作用。实验数据运用SPSS进行数据的分析与处理，采用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析不同浓度对小球藻生理影响的差异(*、**表示暴露组与空白对照组具有差异性，其中*代表P<0.05，**代表P<0.01)。

2 结果(Results)

2.1 锌与BPA对普通小球藻生长抑制的毒性作用

根据以上方法获得锌与BPA对普通小球藻的单一、复合暴露的浓度-效应曲线(图1)及EC50值(表2)。由表2可知，锌和BPA对普通小球藻的EC50分别为5.10 mg·L-1和17.37 mg·L-1，即锌离子对普通小球藻的生长抑制更为明显，其毒性大于BPA。锌和BPA复合暴露情况下的EC50值分别为0.96 mg·L-1和2.18 mg·L-1，相加指数法求得复合暴露对小球藻急性毒性的AI为2.187，由此判断锌-BPA对小球藻的联合作用类型为协同作用。

2.2 锌与BPA对普通小球藻叶绿素含量的影响

普通小球藻在不同锌浓度单一暴露组中叶绿素含量变化如图2(a)所示，小球藻在低质量浓度(0.05 mg·L-1和0.25 mg·L-1)锌暴露7 d后，叶绿素含量分别为(4.60±0.15)×103μg·L-1和(4.06±0.08)×103μg·L-1，均高于空白对照组，说明低浓度锌可以促进小球藻生长过程及光合作用。在BPA单一暴露体系中(图2(b))，不同BPA浓度下普通小球藻的叶绿素含量均随时间的延长有不同程度的增长，但均低于空白对照组，且随着BPA浓度增大，叶绿素含量的增长幅度逐渐下降。在锌和BPA复合暴露体系中(图2(c))，仅当锌和BPA质量浓度组合低于(2.00+6.80) mg·L-1时，普通小球藻可保持较稳定的增长趋势；而当锌和BPA质量浓度组合高于(4.00+13.60) mg·L-1，普通小球藻的叶绿素含量受到明显的抑制作用，且暴露7 d后低于初始接种的叶绿素含量，对叶绿素含量的抑制率分别高达90.46%、97.56%、99.51%和99.76%。复合暴露体系对藻细胞叶绿素含量的高抑制性，在一定程度上支持了锌与BPA复合暴露对普通小球藻的毒性效应为协同作用的结论。

2.3 锌与BPA对普通小球藻生理特性的影响

在本实验中，各暴露组小球藻的可溶性蛋白含量相较于空白对照组都有明显的提升。锌、BPA对普通小球藻可溶性蛋白含量的影响如图3所示，其中，锌、BPA单一及复合暴露中普通小球藻的最高可溶性蛋白含量分别为对应批次中空白对照组的25.56倍、15.62倍和25.51倍。

图1 锌与BPA对普通小球藻生长抑制率的剂量-效应曲线注：(a)、(b)分别代表锌与BPA单一及复合暴露体系。Fig. 1 The dose-effect curve of zinc and BPA on the growth inhibition ratio of Chlorella vulgarisNote: (a) and (b) respectively represent single and compound exposure systems of zinc and BPA.

表2 线性拟合模型参数、EC50值和联合作用类型Table 2 Parameters of linear fitting model, the EC50 values and the joint action type

图2 不同暴露条件下普通小球藻的叶绿素含量变化注：(a)、(b)、(c)分别代表锌单一、BPA单一及两者复合暴露体系；下同。Fig. 2 Changes of chlorophyll content in Chlorella vulgaris under different exposure conditionsNote: (a), (b), and (c) respectively represent single zinc, single BPA, and compound exposure systems of both; the same below.

普通小球藻经不同污染物暴露7 d后，其细胞内的SOD活性变化如图4所示。较低质量浓度暴露组(锌：0.05 mg·L-1；BPA：1.00 mg·L-1；锌+BPA：(0.50+1.70)、(1.00+3.40)和(2.00+6.80) mg·L-1)中，普通小球藻的SOD活性与空白对照组相比无明显差异；而在3种高浓度暴露组(锌：10.00 mg·L-1；BPA：30.00 mg·L-1；锌+BPA：(8.00+27.20) mg·L-1)中的SOD峰值分别为对应空白对照组的8.09倍、5.56倍和18.28倍。这表明锌及BPA的存在使得小球藻受到污染胁迫，并诱导细胞通过提高SOD产量来清除体内过量的氧自由基。

普通小球藻细胞内MDA含量呈现出随污染物浓度的提高而增加的趋势(图5)，其中最大浓度组的锌、BPA单一及复合暴露体系(锌：10.00 mg·L-1；BPA：30.00 mg·L-1；锌+BPA：(32.00+108.80) mg·L-1)中MDA含量分别为空白对照组的2.43倍、2.51倍和3.83倍。锌、BPA单一及复合暴露组中，除了第一个低质量浓度组(锌：0.05 mg·L-1；BPA：1.00 mg·L-1；锌+BPA：(0.50+1.70) mg·L-1)外，普通小球藻的MDA含量均显著高于空白对照组。

3 讨论(Discussion)

在实际的生态环境中，污染物往往不是以简单的单体形式存在，而是多种污染物混合存在的复杂体系[17]，复合污染构成了对生态环境和人体健康的潜在威胁。王桂祥等[18]在研究环境浓度下抗生素对普通小球藻的毒性时发现，红霉素、恩诺沙星及磺胺甲恶唑两两联合时对小球藻均为协同作用；章小强等[19]在研究镉与S-异丙甲草胺的联合毒性时，发现2种污染物对斜生栅藻的联合作用表现为低浓度协同，高浓度拮抗；莫凌云等[20]研究重金属(镍、锌、镉与铬)及农药(敌敌畏与敌百虫)混合物在不同浓度比的毒性相互作用，以费氏弧菌的发光抑制急性毒性为响应值，发现4种重金属与2种农药具有明显的协同作用。若仅采用单一污染物进行毒性研究，可能会导致对该污染物在水环境中造成的毒性效应判断的不准确[21]，所以，我们在对水环境污染状况进行评判时，同时还要确定多种污染物的联合效应，为混合污染物的毒性作用研究提供更重要的参考数据[22-23]。在本实验中，单一暴露体系的锌和BPA对普通小球藻的EC50值分别为复合暴露体系的5.31倍和7.98倍，即锌与BPA的联合毒性显著大于单一的锌和BPA的毒性，并根据相加指数法计算得到2种污染物对普通小球藻的联合作用为协同作用。这可能是由于金属元素以自由离子存在时，不具备(或具备极微弱)生理活性，当生物体对金属离子进行生物积累时[24]，金属离子与特定结构的生物配体结合才可表现出生理活性，同时取代了生物大分子中的必需金属，从而可能改变生物大分子的活性部位的构象，导致生物体中毒[25]。当重金属与环境激素复合暴露时，BPA可能通过有机配体与锌离子发生络合或螯合作用，从而形成毒性更高化合物；同时，微生物对低浓度重金属具有“毒物兴奋效应”，重金属通过干扰微生物的内稳态、刺激微生物分泌更多的胞外物质等促进微生物的生长和代谢[26]，这一过程将会对微生物降解和转化BPA产生一定影响。

图3 锌、BPA对藻细胞可溶性蛋白含量的影响注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 3 Effects of zinc and BPA on soluble protein content of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

图4 锌、BPA对藻细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 4 Effects of zinc and BPA on superoxide dismutase (SOD) activity of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

图5 锌、BPA对藻细胞丙二醛(MDA)含量的影响注：*表示P<0.05，**表示P<0.01。Fig. 5 Effects of zinc and BPA on malondialdehyde (MDA) content of algaeNote: *represents P<0.05; **represents P<0.01.

光合作用是植物体内最重要的生命活动，可为植物的生命活动提供物质与能量[27]，叶绿素是各种浮游藻类中广泛存在的色素，其含量能客观反映植物的生长情况和光合作用水平[9]。有研究表明，在高硝酸盐和低叶绿素(high nitrate and low chlorophyll, HNLC)条件下，功能性营养物质(特别是铁和锌)易造成海洋中藻类爆发[28-29]。HNLC理论也可以用来解释锌在城市水系中引起的水华现象[30]。这一现象一定程度上证明低浓度的锌会促进藻类生长，从而叶绿素含量增加。而在较高质量浓度(1.00、5.00和10.00 mg·L-1)下叶绿素含量受到明显抑制，说明摄入过高浓度的锌则会降低水生生物的生长速度、破坏其光合系统，这与已有研究结果一致[31-32]。Xiang等[9]通过研究BPA对拟柱胞藻和四尾栅藻叶绿素影响发现，当BPA质量浓度为1.00、5.00和10.00 mg·L-1时，拟柱胞藻的叶绿素浓度下降了39.56%、47.00%和74.51%，而在四尾栅藻中则下降了45.39%、67.80%和82.59%。在本实验中，经同样质量浓度的BPA(1.00、5.00和10.00 mg·L-1)暴露7 d后，3组普通小球藻叶绿素含量与空白对照组相比分别下降了15.29%、45.86%和55.96%。虽然不同的藻类对BPA的敏感度不同，但已有数据表明BPA对普通小球藻的光合反应具有抑制效果，抑制叶绿素的合成。

在外界胁迫条件下，植物细胞通过改变体内有机物含量来提高细胞耐受程度，增强蛋白质合成代谢，参与渗透调节，从而适应逆境[33-34]。因此可通过测定普通小球藻体内可溶性蛋白含量来判断锌及BPA对其的毒性效应。在本实验复合暴露组中，当锌与BPA质量浓度高于(8.00+27.20) mg·L-1，可溶性蛋白含量呈下降趋势，说明锌与BPA的联合毒性阻碍了普通小球藻的正常生长代谢。这可能是藻细胞无法抵抗外界胁迫，污染物促进了蛋白水解酶的活性，从而加快蛋白质的水解；同时，由于污染物的毒害作用，使合成蛋白质的相关细胞器受到损伤而抑制可溶性蛋白的合成[35]。

此外，植物在经受胁迫的同时，体内活性氧(reactive oxygen species, ROS)自由基增多，生物体依靠体内抗氧化酶对氧自由基清除，从而保持机体氧化平衡[36]。SOD是生物体内重要的抗氧化酶，能够催化超氧化物阴离子发生歧化作用，生成H2O2和O2[37]。同时，过多的氧自由基将攻击藻细胞膜中的多不饱和脂肪酸，引发或加剧脂质过氧化作用，并形成脂质过氧化物[18,38]。MDA作为膜脂质过氧化的重要产物，其含量变化可反映机体细胞损伤程度。在本研究中，当锌与BPA的质量浓度为(4.00+13.60) mg·L-1时，SOD活性大幅提升，并在质量浓度为(8.00+27.20) mg·L-1时达到最高值后呈下降趋势，其对应的MDA含量也于(4.00+13.60) mg·L-1暴露组大幅提升。这表明从(8.00+27.20) mg·L-1暴露组开始，普通小球藻细胞产生的SOD不足以抵抗污染物引起的氧化胁迫，抗氧化酶的清除速率低于氧自由基的产生速率，从而导致氧化损伤。

本文研究锌与BPA单一及复合暴露条件下对普通小球藻的生长及生理指标的影响，为重金属与环境激素类的复合效应研究提供一定数据基础。然而，2种混合污染物对水环境的毒性作用机理的研究尚未阐明，今后的研究应重点考虑到复合污染物间的互相作用以及微生物对污染物的转化问题。