梁为纲，牛琳，王珺瑜,2，王晓蕾，吴爱明，汪霞，赵晓丽,*

1. 中国环境科学研究院，环境基准与风险评估国家重点实验室，北京 100012 2. 北京师范大学水科学研究院，北京 100875

铅是一类在自然界中普遍存在的重金属元素，主要通过人为活动源，如矿山开采、化工冶炼的排放等方式进入自然水环境。水体中可溶态的铅毒性较大，主要以离子形态存在，可被生物直接吸收，具有蓄积性、沿食物链转移富集、污染后不易被发现并难以恢复等特点[1-2]，较小的剂量也能够对生物产生毒性[3]。铅及其化合物已被列入我国水环境优先控制污染物黑名单，同时铅也是我国地表水环境质量标准(GB 3838—2002)的基本项目之一。针对铅的水环境质量基准和标准的研究具有重要意义。

美国是最早开展铅的淡水水质基准研究的国家，于1980年和1984年分别发布和修订了铅的水环境质量基准文件[4-5]。继美国之后，加拿大、澳大利亚和新西兰也都先后制定了本国铅的水环境质量基准[6-7]。而我国相关的水质基准研究工作起步较晚，相对落后。近年来，国内针对铅的淡水水质基准已有一些初步讨论[8-13]，但研究数量较为有限，且基准推导过程中几乎均未考虑水质参数对铅水质基准的影响以及铅的生物有效性浓度问题。研究显示，水体pH、硬度、碱度、盐度、腐殖质和粘土悬浮液等因素均会对铅的毒性产生影响[14-17]，但相较而言，水体硬度对铅化合物的水生生物毒性影响最具广泛性，二价铅离子和钙离子可以作用于相似的靶点，产生拮抗作用，从而降低铅的生物可利用性，随着水体硬度的增加，铅的化合物对多种水生生物毒性作用显著降低[18-19]。美国、加拿大和澳大利亚等国家在制定本国铅的水质基准时，均将水体硬度作为校正参数，校正方法基本以美国为准，美国环境保护局(US EPA)在1985年发布的水质基准指南中提出应使用协方差分析来考虑毒性与水体硬度之间的关系。此外，基于水体中铅形态的多样性，US EPA在1993年发布的相关报告中推荐使用溶解态铅浓度替代之前广泛使用的总可回收铅浓度和酸溶性铅浓度[20]，因为溶解态铅浓度更能反映铅在水体中的生物有效性部分，同时，采用相应转换因子可进行不同硬度下总铅和溶解态铅浓度之间的转换，而当前我国的相关研究在铅的基准推导过程中均未考虑这一问题，最终的推导结果可能存在较大不确定性。

基于以上问题，本研究结合我国生物区系的特点，从毒性数据库及现有文献中搜集相关水生生物物种的毒性数据，通过2种典型的硬度校正法对毒性数据进行校正后，采用物种敏感度分布法(species sensitivity distribution, SSD)推导铅的淡水水生生物水质基准，最终基准值通过溶解铅转换因子将总铅浓度转换为溶解铅浓度表示，并在此基础上针对2种硬度校正法所推导的结果展开初步的对比分析与讨论，以期为我国铅的淡水水质基准制定和水质安全管理提供支持。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 毒性数据搜集和筛选

参照我国淡水水生生物水质基准制定技术指南(HJ 831—2017)，搜集并筛选铅的化合物对淡水水生生物的急性毒性数据半致死浓度(LC50)、半抑制浓度(EC50)和慢性毒性数据无可见效应浓度(NOEC)、最低可见效应浓度(LOEC)、最大允许浓度(MATC)等，毒性数据主要来自US EPA的ECOTOX数据库(http://cfpub.epa.gov/ecotox/)、中国知网(www.cnki.net/)和Web of Science所收录的文献，数据收集截至2020年6月。筛选原则主要包括：(1)在实验设计方面，剔除在实验中未设置对照组、对照组生物表现异常、实验用水为蒸馏水或去离子水的毒性数据等；(2)在暴露条件方面，剔除未说明实验暴露方式、暴露时间不适宜、实验中溶解氧饱和度等条件不适宜的毒性数据；(3)在优先性选择方面，同一物种优先选择采用流水式暴露的实验获得的毒性数据、同一物种的毒性数据中LC50优先于EC50，MATC优先于NOEC和LOCE、不同生命阶段的毒性数据中优先选用相对敏感生命阶段的数据等；(4)在水体参数方面，剔除未说明实验水体硬度的毒性数据；(5)在物种选择方面，主要保留我国本土物种以及少量国际通用种和引进物种，剔除生物学资料不明的物种以及外来入侵物种。此外，鉴于铅的可用毒性数据绝大多数以总铅浓度表示，因此本研究只保留所有总铅浓度的数据。

1.2 水体硬度校正方法

参考第三次全国地表水水质评价结果[21]，我国地表水水体硬度<150 mg·L-1的水面积占我国地表水总面积的比例为42%，且US EPA在推荐的水质基准表中铅的推荐值所对应的水体硬度为100 mg·L-1(以CaCO3计)，因此本文将所有毒性数据统一校正到硬度为100 mg·L-1(以CaCO3计)的水平，校正方法的核心即斜率的归一化，具体如下。

1.2.1 集合斜率法

参考US EPA于1984年修订的铅的水环境质量基准文件，采用求“pooled slope”的硬度校正方法。该方法选择的物种须具备的条件包括：具有多条在不同硬度条件下的毒性数据，并要求同一物种的多条毒性数据中，最高硬度值至少是最低硬度值的3倍，且至少>100 mg·L-1(以CaCO3计)。按照图1所示步骤，可求得集合斜率(KP)。该方法旨在排除物种类别差异的影响，建立硬度-毒性值之间独立的线性关系。之后将KP代入式(1)和式(2)进行毒性数据的硬度校正。

1.2.2 标准斜率法

本研究同时采用标准斜率法对毒性数据进行校正[22]，具体步骤如下：

(1)分别计算每个物种可获得毒性值的几何平均值，然后用该物种的每个毒性值除以该值，进而得出物种标准化毒性值；

(2)同样分别计算每个物种的相应的硬度值的几何平均值，然后用该物种的每个硬度值除以该值，进而得出每个物种的相应的标准化硬度值；

(3)把所有物种标准化毒性值看作是同一物种的数据，然后以所有物种标准化毒性值的对数值为因变量，以相应的硬度标准化值为自变量，进行最小二乘回归，进而得到所有物种的毒性值与硬度关系的标准斜率(KS)，后同样代入式(1)和式(2)进行硬度校正。

lg(cH0,Pb)=K×lg(H0)+C

(1)

cH,Pb=10K×lg(H)+lg(cH0,Pb)-K×lg(H0)

(2)

式中：cH0,Pb为硬度校正前的毒性值(μg·L-1)；cH,Pb为硬度校正到H水平下的毒性值(μg·L-1)；H0为硬度校正前的水体硬度值(mg·L-1)；H为校正的任意目标水体硬度值(mg·L-1)；K为校正斜率；C为毒性常数。

1.3 基准推导

把所有毒性数据校正到同一硬度水平后，通过计算同物种毒性数据的几何平均值，得到各物种的种平均急性毒性值(species mean acute value, SMAV)和种平均慢性毒性值(species mean chronic value, SMCV)，按数值大小对物种敏感性进行排序，并对SMAV和SMCV分别进行正态分布检验(K-S检验)，若不符合正态分布，需进行对数转换后重新检验。计算SMAV时，只纳入LC50和EC50，计算SMCV时，优先通过计算LOEC和NOEC的几何平均值获得MATC后，再统一纳入计算。

图1 毒性数据硬度校正中集合斜率的推算过程Fig. 1 The calculation process of “pooled slope” in the hardness correction of toxicity data

将物种SMAV/SMCV或其对数值分别从小到大进行排序，确定其毒性秩次R(最小毒性值的秩次为1，次之秩次为2，依次排列，如果有2个或2个以上物种的毒性值相同，则将其任意排成连续秩次，每个秩次下物种数为1，依据式(3)分别计算物种的累积频率(FR)。

(3)

式中：FR为累积频率，指毒性秩次1至R的物种数之和与物种总数之比(%)；f为频数，指毒性秩次R对应的物种数。

采用SSD方法，以通过正态分布检验的毒性数据为横轴，对应的累积频率为纵轴，利用正态分布模型、对数正态分布模型、逻辑斯谛分布模型和对数逻辑斯谛分布模型进行SSD模型拟合。拟合软件为MATLAB R2018a(Math Works)。依据模型拟合的决定系数(R2)、均方根(RMSE)、残差平方和(SSE)以及K-S检验结果，确定最优拟合模型。然后确定累积频率5%所对应的横轴毒性值，即为急性/慢性5%物种危害浓度(HC5)。HC5除以评估因子2(根据《淡水水生生物水质基准制定 技术指南》(HJ 831—2017)，f>15且涵盖足够营养级，评估因子取值为2)，在此基础上，乘以US EPA推荐的对应硬度条件下的溶解铅浓度转换因子，即为淡水水生生物短期和长期基准，溶解铅浓度的转换因子的计算见式(4)[23]。

CF=1.46203-[(lnH)×0.145712]

(4)

式中：CF为转换因子；H为水体硬度(mg·L-1)。

2 结果(Results)

2.1 铅的生物毒性数据

经搜集和筛选后，共有93条数据可用于基准推导，其中，急性毒性数据58条(表1)，慢性毒性数据35条(表2)。急性毒性数据囊括6门22科共38个物种，慢性毒性数据囊括7门12科共16个物种，共涉及47个物种，其中我国本土物种33个，占比超过70%，物种覆盖3个营养级(初级生产者、初级消费者和次级消费者)，5个代表性生物类群(硬骨鲤科鱼类、硬骨非鲤科鱼类、浮游动物、底栖动物和水生植物)，基本可以反映我国的生物区系特征。

表1 铅对淡水水生生物的急性毒性数据Table 1 Acute toxicity data of lead to freshwater aquatic organisms

2.2 硬度校正结果

2.2.1 集合斜率法

如表3所示，对物种急性毒性数据进行筛选后，得到4类满足要求的物种，包括鲤鱼、黑头软口鲦、大型溞和斑马鱼，其经对数转换后的毒性值与硬度值的线性斜率分别为0.815、0.390、1.122和0.969，经检验P=0.312>0.05，表明物种间斜率不存在显著差异，接受斜率同质性假设，协方差分析结果得到集合斜率为0.962，且二者呈现显著的线性相关关系。以同样方法对物种慢性毒性数据进行筛选，只获得大型溞和虹鳟2个物种(表4)，且回归分析结果显示虹鳟的毒性数值与硬度之间不存在线性相关性，大型溞的毒性数值与硬度之间虽具有显著线性关系，但其斜率为2.657，与1相差较大，不适于作为总体的集合斜率来推导长期基准值[4]。

表2 铅对淡水水生生物的慢性毒性数据Table 2 Chronic toxicity data of lead to freshwater aquatic organisms

在缺乏慢性数据的情况下，一般通过计算急慢性毒性比(ACR)，进而基于短期基准计算长期基准，但由于铅的慢性毒性数据本身较少，不满足相关数据要求。因此，考虑在集合斜率法的基础上进行修改，即在单一物种难以满足要求的情况下，按物种类别对各单一物种进行归类，如表5所示，将物种归类为脊索动物、节肢动物、软体动物和藻类，分类后数据满足要求。分析结果显示对于软体动物和藻类，其毒性值和硬度不存在线性相关性，因此只保留脊索动物和节肢动物进行协方差分析，分析结果中集合斜率为0.701，斜率同质性检验P值>0.05，故该斜率被用作对慢性毒性数据的硬度校正。

2.2.2 标准斜率法

如图2所示，将全部物种的标准化急性毒性值(ATVS)和标准化慢性毒性值(CTVS)与对应的标准化水体硬度(HS)进行最小二乘回归分析，对于急性数据，其线性关系斜率为0.9525，且存在显著的线性相关性(P<0.01)，对于慢性毒性数据，斜率为1.1042，同样存在显著线性关系(P<0.01)。该方法对数据要求低，能够满足一般基准推导中对硬度校正的需求，但其忽略了不同物种间可能存在的硬度-毒性关系的差异，存在一定局限性。

表3 物种急性毒性值和硬度的协方差分析结果Table 3 Covariance analysis results of acute toxicity versus hardness

表4 物种慢性毒性值和硬度的协方差分析结果Table 4 Covariance analysis results of chronic toxicity versus hardness

表5 物种分类后慢性毒性值和硬度的协方差分析结果Table 5 Covariance analysis of chronic toxicity and hardness after species classification

本研究将2种方法得到的校正斜率同时用于毒性数据的硬度校正，图3分别为急性毒性数据和慢性数据中使用2种校正方法所得结果的对比，2组数据近似满足于y=x的线性关系，对急性数据而言，2种校正方法结果基本一致，经单因素ANOVA检验，P值为0.988，证明在100 mg·L-1的硬度水平下2组校正结果几乎没有差异，2组慢性数据虽具有一定差异，但显著性P值为0.706，在统计学意义上并不显著。

2.3 铅的水质基准值推算

将校正后的急/慢性毒性数据按物种分类并计算各物种的种平均急/慢性毒性值，经对数转换后，K-S检验P值均>0.05，服从正态分布。依据《淡水水生生物水质基准制定 技术指南》(HJ 831—2017)，用4种累积概率分布模型拟合物种毒性数据，通过对比决定系数、均方根等拟合优度参数，得到正态分布模型最适用于短期基准推导，逻辑斯谛分布模型最适用于长期基准推导，标准斜率法的短期和长期基准拟合曲线如图4(a)和4(b)所示，图4(c)和4(d)为集合斜率法所得拟合曲线。对于短期基准，计算得到2种方法对应的HC5分别为229.4 μg·L-1和227.0 μg·L-1，评估因子取值为2，对应硬度下溶解铅的转换因子(CF)为0.791，则短期基准值分别为90.7 μg·L-1和89.8 μg·L-1，对于长期基准，2种方法对应的HC5分别为5.4 μg·L-1和7.9 μg·L-1，则长期基准值分别为2.1 μg·L-1和3.1 μg·L-1。由图4可知，无论哪种校正法，对铅的急性毒性最敏感的4类物种均为蚤状钩虾(G.pulex)、模糊网纹溞(C.dubia)、罗氏沼虾(M.rosenbergii)和端足类钩虾(G.pseudolimnaeus)，对铅的慢性毒性最敏感的4类物种分别为端足虫(H.azteca)、静水椎实螺(L.stagnalis)、羊角月牙藻(P.subcapitata)和端足类钩虾(G.pseudolimnaeus)，相比于节肢动物、软体动物等无脊椎动物，脊椎动物整体对铅的毒性较不敏感。

图2 急性毒性值(a)和慢性毒性值(b)与水体硬度的线性回归分析注：ATVS表示标准化的急性毒性值(μg·L-1)，CTVS表示标准化的慢性毒性值(μg·L-1)。Fig. 2 Linear regression analysis of acute toxicity (a) and chronic toxicity (b) and water hardnessNote: ATVs is standardized acute toxicity value (μg·L-1), and CTVs is standardized chronic toxicity value (μg·L-1).

图3 2种方法分别对急性毒性数据(a)和慢性毒性数据(b)的校正结果对比Fig. 3 Comparison of the two methods for the correction results of acute toxicity data (a) and chronic toxicity data (b)

我国地缘辽阔，河流湖泊众多，全国地表水质评价结果显示我国天然水体的硬度存在较大差异[21]，为便于水质基准在实际环境管理中的应用，本研究基于校正斜率和总铅浓度下的基准值，分别得到符合我国生物区系特点的铅的短期和长期基准值推算公式，在该公式基础上，只需结合某一水体的硬度值，即可估算出对应硬度下的短期或长期基准值，如表6所示。

3 讨论(Discussion)

理论上，集合斜率法充分考虑了物种类别对毒性-硬度关系的影响，通过假设检验消除物种间斜率的显著差异，所得校正斜率能够较为真实地反映出毒性与硬度间的独立线性关系，相较标准斜率法更加科学。一般而言，每个物种的毒性数据越多且对应硬度值跨度越大，理论上获得的斜率越准确，也正因如此，该方法对数据要求较高，一些毒性数据较为缺乏的物质很难满足要求，在这种情况下，标准斜率法更为适用，该方法将所有物种的毒性数据和硬度标准化后直接建立线性关系得到校正斜率，对数据要求较低，但所得斜率较为粗略，不作为优先选择。集合斜率法不仅适用于铅的水质基准推导，也适用于其他类似的水溶态金属，如镉、铬(Ⅲ)和镍等，在US EPA水质基准推导中均有应用[23]，但我国目前并未有研究采用该种校正法。石慧等[71]在铝的水质基准推导中，由于毒性数据缺乏，将符合要求的毒性数据和硬度直接建立线性关系以获得校正硬度。本文尝试根据物种的共性特征，将物种进行分类以达到数据分析要求，是该问题的解决方法之一，但其科学性可靠性仍有待进一步证实。

就本研究中2种硬度校正法的结果对比而言，短期基准值十分相近，这说明在数据较为丰富的前提下，2种校正方法或许可近似替代。对于长期基准，集合斜率法所得结果要明显大于标准斜率法，且硬度越高，差异越大，这主要是校正斜率本身存在明显差异所致。本研究中慢性毒性数据量的缺乏使得集合斜率法不适用于长期基准的推导，尝试修改方法，软体动物和藻类这2个毒性受硬度影响较大的物种门类在斜率同质性检验中被剔除，导致最终得到的校正斜率明显偏小，所得结果可能具有较大的不确定性，因此，在实际推导中毒性数据的数量及质量往往决定着不同校正方法的准确性。就本研究而言，急性毒性数据较充足，集合斜率法为优先选择，而在数据量较少的长期基准推导中，标准斜率法较为适用。

表6 不同硬度条件下铅的水质基准推算公式Table 6 Water quality criteria calculation formula of lead under different hardness conditions

为便于与美国的基准值比较，根据表6中的公式分别推算出硬度为50 mg·L-1和200 mg·L-1(以CaCO3计)水平下的短期和长期基准值，并在未校正硬度的情况下，使用同样的毒性数据推导铅的水质基准值，根据模型拟合效果，短期和长期基准拟合的最优模型与数据校正后保持一致，如图5所示。与未校正硬度下所推导出的基准值对比发现，虽然敏感物种的类别未发生明显改变，模糊网纹溞、端足类钩虾和蚤状钩虾等节肢动物始终作为最敏感物种出现，但水体硬度对铅的水质基准值产生的影响显而易见，如表7所示，在本研究中未校正硬度所得水质基准值约相当于硬度校正到30 mg·L-1(以CaCO3计)水平下的基准值。

图5 硬度校正与未校正下铅的短期(a)和长期(b)基准值对比Fig. 5 Comparison of short-term (a) and long-term (b) water quality criteria of lead in hardness corrected and uncorrected

按物种敏感性排序，美国1984年发布的铅的短期水质基准中前10%的敏感物种为端足类钩虾(G.pseudolimnaeus)，本研究则为蚤状钩虾(G.pulex)、模糊网纹溞(C.dubia)、罗氏沼虾(M.rosenbergii)和端足类钩虾(G.pseudolimnaeus)，敏感物种类别较为相近，主要为溞科和钩虾科，但基准值存在一定差异，其中原因可能包括基准推导方法、物种数量及个别物种的毒性数据质量的差异。美国短期基准中黑头软口鲦和孔雀花鳉的SMAV要比本研究大20多倍，其数据均来源于1966年Pickering和Henderson的一项研究[72]，相较而言，本研究中这2个物种的数据来源于3篇不同文献，发表年份较新，且毒性实验方法经过了质量评价。此外，美国短期基准推导中只纳入10个物种，而本研究纳入了38个物种，物种覆盖范围较广，其中大部分为我国本土物种，物种的敏感性存在较大差异。最后基准推导的方法不同，美国采用的是毒性百分数排序法，本文推导基准采用的是概率物种敏感度分布法。长期基准值同样存在明显差异，由于慢性数据缺乏，US EPA在铅的长期基准推导中使用了急慢性毒性比值法，在计算急慢性比时共纳入4个物种，其中还包括一类咸水物种(Mysidopsisbahia)，获得的最终急慢性比(FACR)为52.19[4]，其与US EPA[73]、国际经济合作与发展组织(OECD)[74]和澳大利亚[75]推荐使用的急慢性比率默认值10存在明显差异。此外，如表7所示，本研究所得基准值与何丽等[8]和王菲等[10]的研究结果均存在一定差异，可见在铅的水质基准推导中存在着较多的不确定性因素，其中水体硬度对铅生物毒性的影响及二者间的定量关系已被很多研究发现并证实，应尽可能地考虑这类参数以降低基准推导中的不确定性。

依据表6中铅的水质基准与硬度的关系式，结合我国地表水的硬度范围(50～450 mg·L-1)，可以得到铅水质基准的大致范围，如图6所示。在我国地表水环境质量标准(GB 3838—2002)中，Ⅰ、Ⅱ类水体是针对珍稀、敏感水生生物的保护，标准限值为<0.01 mg·L-1，Ⅲ类水体则是针对鱼虾越冬场、洄游通道、水产养殖等渔业的保护，标准限值为<0.05 mg·L-1。在硬度范围内，本研究得到的铅的短期水质基准值整体位于铅的Ⅲ类标准限值之上，证明现行的铅的水环境质量标准能够最大程度上保护水生生物免受铅的急性毒性影响。而对于铅的长期基准而言，即使采用标准斜率法得到的基准值也仅在极高的硬度条件下处在铅的I、Ⅱ类标准限值之上，绝大部分硬度条件下均低于I、Ⅱ类标准限值，因此，现行标准可能无法有效地保护水生生物免受铅的慢性毒性的影响。

图6 不同硬度下水质基准与地表水环境质量标准的对比Fig. 6 Comparison of water quality criteria and surface water environmental quality standard under different hardness

表7 不同硬度校正情况下铅的水质基准比较Table 7 Comparison of water quality criteria of lead under different hardness correction conditions

值得注意的是，在基准推导中，选用不同形态的物质浓度同样会对所得基准值产生显著影响，这往往是国内其他相关基准研究所忽视的一个问题。US EPA在1980年和1984年发布的铅的水质基准中分别使用了总可回收铅浓度(total recoverable lead)和酸溶性铅浓度(acid-soluble lead)，除铅以外，总可回收物质浓度和酸溶性物质浓度也是US EPA在众多水溶态金属物质，如镉、铬(Ⅲ)、铬(Ⅵ)、铜、铅、汞和镍等的基准推导中广泛采用的浓度类型，其适用于大部分的毒性实验，兼容性较好，能够测量所有有毒形态或可能转化为有毒形态的物质浓度。但之后更多研究表明溶解态金属浓度更能反映出水体中金属的生物有效性部分，于是从1993年起，US EPA推荐在基准推导中使用溶解态金属浓度，即金属溶液需经过一个0.45 μm的滤膜过滤[20]。本研究同样采用溶解铅浓度进行基准的推导，并借鉴US EPA于2016发布的最新的镉的基准计算方法[76]，在数据筛选过程中，只保留浓度类型为总铅浓度的毒性数据，将所得到的代表总铅浓度的基准值乘以不同硬度条件下的转换因子，即得到代表溶解态铅浓度的水质基准值，这也是导致本研究与美国基准值以及我国其他研究结果差异的原因之一。理论上该方法所得限值更能反映水体中铅的生物有效性浓度，在实际应用中能够对水生生物起到更加有效的保护作用，但同时，不同形态铅浓度的转换在一定程度上也增加了基准的不确定性。

综上所述，水体硬度校正在铅的水质基准推导中非常必要。本研究采用2种典型的硬度校正法对毒性数据进行校正处理后，通过SSD模型拟合得到在水体硬度为100 mg·L-1(以CaCO3计)水平下，2种校正法所得铅的短期水质基准十分相近；在数据量较少的情况下，集中斜率法表现出较大不确定性，导致2种方法所得的长期基准在高硬度水平下差异明显，标准斜率法为更优选择。在诸如镍、锌、银、镉和铬(Ⅲ)等具有类似性质的水溶态金属的基准推导中，该研究结论具有一定的借鉴意义。此外，不同硬度下水体中物质的形态及生物有效性浓度也是未来水质基准研究中需要关注的问题。