户乃丽 徐晓雪 邹林樾 田 蜜 赵君朋

(首都医科大学中心实验室，北京100069)

肝脏含有丰富的免疫细胞一枯否细胞(Kupffer Cells，KCs)细胞，KCs是组成机体单核一巨噬细胞系统最大的群体。KCs具有吞噬、免疫调节及监视等功能，2在肝脏的炎性反应、缺血再灌注损伤、移植免疫等方面发挥着重要作用[1-3]。小鼠KCs以其表面表达 F4/80、CD11b、CD68 和 C 型凝集素结构域家族4成员F为特征表[4,5]。KCs具有异质性、极化性，尽管各型巨噬细胞均表达F4/80，但根据其来源和环境的不同KCs存在多种表型和亚群，各型之间也可相互转化，相对于选择性贴壁法和磁珠分选法，流式细胞分选在多参数细胞亚群识别上有着更好的应用。目前，流式细胞分选广泛应用于血液或脾脏，肺脏等组织器官上目的细胞的筛选[6-8]，本实验拟利用密度梯度离心结合流式细胞4色标记分选纯化KCs，探索适宜KCs分选的实验条件并对分选后的KCs进行活性、表型及功能的检测。

1 材料与方法

1.1 实验动物

BALB/c小鼠(10只雄性)，SPF级，体质量28～30g，5～6 周龄，购于大学实验动物部。

1.2 试剂与仪器

胶原酶IV、台盼蓝试剂外购；RPMI-1640培养基、胎牛血清外购；OptiprepTM 密度梯液、7-AAD染料、CD45-BV421、CD11b-APC、F4/80-PE、CD86-FITC、CD206AF700抗体外购；FITC荧光微珠外购；小鼠TNF-α、IL-1βELISA试剂盒外购；流式细胞胞仪质控CST微球、Accudrop beads外购；实验所用仪器为BDAriaIII型流式细胞分选仪，配有488nm、561nm、633nm、405nm 4只激光器。

1.3 实验方法

1.3.1肝细胞悬液的制备

胶原酶灌注：小鼠给予100g/mL水合氯醛0.3mL腹腔注射，麻醉后消毒皮毛剪开腹腔，暴露肝脏门静脉，门静脉穿刺并缝合固定，于常温缓慢注入D-Hanks液(无Ca2+，Mg2+，Ph=7.4)至肝脏膨大为原来的2倍大，剪断下腔静脉，肝脏血液被冲出回缩后，继续灌注D-Hanks溶液20mL至肝脏变为白色。……