雪雨田，王亚琴，姜向阳

（西安医学院研究生处，陕西 西安 710000）

1 hWAPL基因的概述

WAPL是在黑腹果蝇体内于1977年第一次所发现，位于果蝇体内的X染色体上2D5-2D5[2]，以增加连接蛋白分离。WAPL基因在人类中的同源基因被称作半翼基因（human wings apart-like，hWAPL），hWAPL基因位于染色体10q23.2位点，长约86528bp，含有17个外显子和2个内含子，其所编码的hWAPL蛋白与WAPL蛋白在保守区域具有高度同源性，同时二者具有极为相似的功能作用，其调节染色质的结构，维持姐妹染色单体的稳定性[3]。近年来，研究发现hWAPL仅在宫颈癌患者的宫颈组织中具有较高的表达特异性，与宫颈癌的发生具有密切的相关性，日本学者Oikawa等[4]应用Northern印迹杂交实验对宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌及其相应的正常组织中的hWAPL基因中mRNA表达水平进行检测，发现与其他癌组织及其相应的正常组织进行比较，只有在宫颈癌组织中hWAPL基因的mRNA表达具有明显的高表达。对于癌细胞系的研究也发现，hWAPL在宫颈癌细胞系表达的程度更高。证明宫颈癌特异性高表达的基因是hWAPL基因。国内鲁笑钦等[5]采用免疫组化方法检测27例正常宫颈、47例宫颈癌及238例其他8种癌组织中hWAPL基因的表达，hWAPL基因在正常宫颈和宫颈癌组织中的阳性表达率分别为33.70%和97.87%。研究表明，在正常宫颈组织、CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ和宫颈癌组织中，随宫颈病变程度的加深，hWAPL的免疫积分及阳性表达率逐步升高，hWAPL基因在正常宫颈上皮细胞中不表达或表达仅局限于少量基底层细胞及基底旁细胞。hWAPL在CINⅠ和CINⅡ的样本中的表达占上皮厚度的50%～70%，而在hWAPL的表达在CINⅢ和浸润性鳞状上皮癌中整个病变上皮。此外，随着病变程度增加，hWAPL的表达水平也随之升高，证明hWAPL与宫颈病变的严重程度密切相关。由于检测到hWAPL在肿瘤组织中高水平的表达，为了明确在肿瘤的发生中是否hWAPL的过度表达有促进作用，在体外实验中，Oikawa等[6]将血凝素(HA)标记的hWAPL表达载体(HA-hWAPL 3T3)或HA表达载体 (HA-3T3)转染小鼠成纤维细胞，并将转染的细胞分别注射到裸鼠体内，观察经注射后的裸鼠的成瘤情况，结果表明，转染HA表达载体的裸鼠未发生肿瘤，而HA-hWAPL 3T3的裸鼠几乎都有发生肿瘤。这证明hWAPL是致瘤性的。在正常小鼠睾丸组织中含有大量的WAPL蛋白，在人类各正常组织的检测也发现相似的情况，人睾丸组织中显示出大量hWAPL mRNA，而其他正常的人类组织中也检测出表达微量的hWAPL mRNA。哺乳动物的WAPL基因对二嗯英很敏感，可以降低使hWAPL蛋白的表达，从而影响精子的发育。在小鼠体内hWAPL基因还与胚胎的发育有关。抑制SiHa细胞中 hWAPL基因表达可导致细胞死亡。HPV或其他因素导致的hWAPL异常表达可导致DNA断裂或不准确修复，存活细胞中的基因重排或多倍体形成，基因组不稳定性从而导致细胞的恶性转化和胚胎发生缺陷。

2 HPV与宫颈癌的关系

人乳头瘤病毒（HPV）是一种常见的嗜黏膜、皮肤的微小DNA病毒，无包膜，在分化状态的细胞中复制，其分子为双链环状，并呈现以共价闭合的高度螺旋化，病毒基因组含有8000左右碱基(bp),由早期区（early region，E)、晚期区(late region，L)、长控制区（long control region，LCR)。早期区含有E1、E2、E4、E5、E6、E7共6个基因，是维持病毒复制，编码病毒蛋白，是维持细胞内病毒的高拷贝数基因[7]。其中E2基因的丢失或灭，导致E6、E7编码的蛋白持续表达和过度表达。高危型HPV最为典型的特点是由E6、E7原癌蛋白来实现诱导终末分化细胞中DNA的合成；E6、E7区为多数HPV亚型的转录起始点，协助参与病毒细胞转化及转录激活，可分别与p53、pRb抑癌基因结合形成复合体，使p53、pRb抑癌作用消失，细胞永生化，与HPV的致癌作用密切相关[8]。病毒基因主要通过染色体易位、缺失、重排和非染色体损害等方式整合到宿主细胞染色体中。染色体突变可激活癌基因和抑癌基因失活。持续感染HPV病毒的人群是高级别宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的高危人群。其原因可能与病毒整合后逃脱机体细胞识别清除、E2负调节蛋白缺失的肿瘤抑制因子[9]。HPV-DNA 在宫颈上皮细胞内的形态主要分为三种：游离型、整合型和二者兼有的混合型。研究发现，低级别上皮内瘤变(CINⅠ)的HPV-DNA呈游离状态，高级别上皮内瘤变(CINII-Ⅲ)与宫颈癌中HPV-DNA多呈整合状态，且整合率随病变加重而显著增加[10]。在过去的几年里，为筛查宫颈癌，人类开发了大量的检测高危型HPV的新方法，目前用于检测HPV整合的方法有：荧光原位杂交法(fluorescence insitu hybridization，FISH)、杂 交 捕 获 法(hybridcapture method，HC)、 Southern 印迹杂交法、连接-介导-PCR 法、多重实时荧光PCR 法、多重连接依赖式探针扩增法 (mult-i junction dependent probe amplification，MLPA)及致癌基因转录子扩增法(amplification of papillomavirus oncogene transcript test，APOT)等。多重实时荧光PCR法是应用最为广泛的方法，该方法是利用不同的荧光基因簇，标记E6和E2基因探针，收集 E2/E6 的不同基因拷贝数，实现病毒的定量。其原理主要为HPV病毒整合后使E2破坏、缺失，E6/E7过度表达，E2的缺失和宫颈病变程度呈正相关，E6/ E7与p53及pRb结合，抑癌作用消失或减弱，导致肿瘤发生。多重实时荧光 PCR法具有高通量和高灵敏度的优点，可避免一定的重组样本误差，因此目前得到了广泛的应用[11]。HPV感染可分为单一亚型感染和多重亚型感染，其中多重亚型感染者发生宫颈癌的概率要高于单一亚型感染者。感染亚型也存在地区和民族差异，在世界范围内 HPVl6和HPVl8为最主要的人群感染亚型，而中国人当中HPVl6、HPVl8、HPV52、HPV58、HPV31、HPV33为最常见的亚型，并且中国南方地区 HPV52、HPV58亚型的感染率较北方地区要高[12]。HPV感染以单一感染为主，感染率随感染亚型增多而下降，一般无四重及四重以上感染，而在多重感染中HPVl6合并型高达41.3%。HPV感染率随宫颈病 变程度加深而增加，有研究显示HPV感染率在宫颈炎中为51.2%，CINⅠ级为77.8%，cIN2级为 92.3%，CIN3级为100%，浸润癌为100%[13]。Leyendecker 等[14]研究发现 HPV1 6-DNA的整合状态与宫颈癌临床分期、病理类型、组织学分化及预后无明显相关性。Gargiulo等[15]研究结果表明，高危型HPV多重感染发展为高级别上皮内瘤变及宫颈癌的风险是高危型HPV单一感染的4倍。另有研究发现，高危型HPV多重感染可增加宫颈上皮内瘤变的风险，但与宫颈癌发生相关性低，在宫颈癌中更常表现为高危型HPV单一感染而非高危型HPV多重感染[16]。Cheung等[17]在HPV16、18双重感染的宫颈癌中发现，HPV-DNA多为混合型，较HPV16或HPV18单一感染的整合率低。

3 hWAPL与HPV的关系

大量研究普遍认为，HPV感染是宫颈癌和大部分CIN的主要原因，hWAPL基因的表达受HPV早期蛋白的影响，HPV E6、E7可分别引起hWAPL表达的升高，也可以联合引起hWAPL表达的升高，但E6和E7联合作用与E6、E7单独作用对hWAPL表达的生高水平无明显区别。因HPV E2蛋白可与HPV早期启动子结合抑制E6、E7的表达，为了证明hWAPL的表达是由E6和E7引起的，Kuroda[18]等分析了E2对hWAPL表达的影响，用编码E2的逆转录病毒去转染表达HPVE6、E7宫颈癌细胞株如与HPV阴性的宫颈癌细胞株C33A，结果发现CaSki和SiHa细胞株中hWAPL的表达水平显著降低，而在C33A细胞株中hWAPL的表达没有明显改变。这些结果表明hWAPL的表达可能是对HPVE6和E7所引起特殊癌前细胞周期的一种反应。在HPV阳性的正常宫颈组织中hWAPL的表达较低，但无论在HPV阳性还是阴性的宫颈癌细胞中，hWAPL均表达较强，同时也可推测出相比HPV，hWAPL基因的过表达也许是宫颈癌发生的直接原因。有研究发现[19]，在宫颈癌病变中hWAPL蛋白可明显高表达，提示宫颈癌的发生和发展可能有hWAPL蛋白的参与，可能通过影响以下因素导致相关指标的异常表达进而促进临床病理特征的进展(1)通过hWAPL蛋白的表达可以增加早期宫颈柱状上皮细胞分裂的异常，增加癌细胞的分化和诱导凋亡障碍，减少癌细胞的凋亡，显著提高生长速度；(2)通过维持肿瘤干细胞的特性，hWAPL蛋白可以提高癌细胞的浸润和侵袭能力。ShruthiPS等研究者在探讨不同临床病情的宫颈癌患者发病机制的过程中，发现hWAPL蛋白的平均表达阳性率可平均可提高25%以上，发现治疗敏感性较差、治疗后缓解率低的患者，hWAPL表达率更明显[20,21]。同时免疫组化分表明：hWAPL蛋白主要位于癌细胞包质中及其周边，表明hWAPL蛋白可能影响癌细胞之间的信号通路，同时干扰细胞内信号传导等，从而促进了宫颈癌的发生。蒋文琛等[19]探讨hWAPL蛋白与宫颈癌患者临床病理特征的关系过程中发现，在细胞分化程度较差、发生淋巴结转移或者临床分期较晚的患者中，hWAP蛋白的表达阳性率较高，这可以从下列几个方面进行理解：(1)hWAPL蛋白上调淋巴结内皮粘附分子adherin1的表达，能够增加宫颈癌细胞通过宫旁、闭孔淋巴结等转移风险；(2)hWAPL浸润邻近宫旁组织的浸润，或阴道壁可能会增加宫颈癌患者的临床分期。在宫颈癌浸润脉管组织的患者中，hWAPL蛋白的表达阳性率可进一步提升，这可能与hWAPL蛋白对于癌细胞的变形、扩散及渗透作用的促进作用有关。

4 展望

宫颈癌的发生是一个多因素，多机制，多阶段的漫长过程，有研究发现大约30%的女性一生中可能感染一次HPV，主要集中在年轻、性生活活跃的女性中，20-30岁为高峰期，多数女性感染后一段时间后无需治疗，靠自身免疫力会在1-2年内自行消失。只有仅少数女性呈现出持续感染，通常需要8-15年发展为子宫浸润癌。在这个漫长的过程中完全可以通过早期筛查来早发现、早诊断、早治疗[22]。目前在临床上的宫颈癌的筛查项目主要为：HPV联合TCT的检测，TCT是一种细胞学检查，检测已发生细胞形态学改变的情况，其受主观性影响比较大，容易出现假阴性。而HPV检测，直接测定的是病毒DNA基因分型，特异性强，准确性高[23]。据刘金凤等人的调查发现[24]，中国相关文献Meta分析中调整后宫颈癌HPV感染率82.7%。从而也说明在有些宫颈癌患者中，筛查HPV的结果为阴性。证明有一定的漏检率，在一定程度上可造成宫颈癌患者漏诊，但在HPV阴性的宫颈癌组织中hWAPL是高表达的，目前WAPL基因在宫颈癌组织中表达的研究尚不深入，但有学者认为可将HPV与血清中hWAPL表达的蛋白产物联合筛查，可提高宫颈癌的确诊率，同时有助于宫颈癌的早发现，早诊断，早治疗，早康复，可提高患者的五年生存率。综上所述在恶性宫颈癌方面的诊治是一个新兴领域，有广阔的应用前景，可被推广。