猪精子冷冻损伤与保护剂的研究进展

2021-12-03郭铭晖魏华凯李雁冰黄大鹏魏国生李井春

猪业科学 2021年2期

张群，王骞，郭铭晖，王硕，魏华凯，李雁冰，黄大鹏，魏国生，李井春

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319）

自2009年起，在国家的大力扶持下，全国范围内建立了多家规模较大、实力较强的公猪站。人工授精技术的普及使全国各地建设成一个完备的种畜精液供应网络，优秀的种畜得到充分利用，加快了养猪行业品种改良进程。此项技术操作简单、生产成本低并且安全高效。在常温环境下精子在长时间、长距离的运输中，保存时间很短，需采用低温冷冻保存技术。现如今牛精液的冷冻保存技术已经非常成熟，但不同物种的精子对温度的敏感程度不同。猪精子在冷冻保存过程中十分容易受损伤，导致精液品质下降。如何在低温保存过程中既最大限度地保留种畜遗传材料，又不会对精子质量造成损伤，在精液在交流过程中有效保证生物安全，是科技工作者们研究和讨论的重点及难点。

1 猪精液冷冻保存技术发展史

早在1949年，Polge[1]等在实验中偶然发现在稀释液中添加一定量的甘油能使经过短暂冷冻后的精子完全恢复活力，精子成为第一个成功冷冻保存的哺乳动物细胞，这为之后的各种器官、组织、细胞等低温冷冻研究提供了依据，特别是使人们开始了对低温情况下细胞受损或死亡原因的研究。随后Polge等在对不同种类哺乳动物精液进行冷冻保存研究时发现，动物种类不同，适宜的甘油浓度也不同，猪精子适宜的浓度为7.5%。此后，美国、法国、澳大利亚、德国等[2]相继报道使用猪冷冻精液成功受精产下仔猪。

中国对猪精液冷冻保存的研究起步较晚。1973年，广东、广西等地开始引入精液冷冻技术，并且迅速进入快速发展阶段。1977年全国猪精液冷冻技术研究协作组成立，对精液冷冻问题开展深入研究并规范操作[3]。近年来，我国在精液稀释液、冷冻保护剂和冷冻程序方法等方面已经取得一定成绩，但在损伤机理方面尚没有完全清楚，需要进行进一步研究探索。

2 精子受冷冻损伤机制

2.1 物理损伤

精液冷冻过程中，物理损伤主要来自温度急剧下降，液体结成冰晶，对细胞膜和细胞内部造成损伤。若能减少大冰晶的产生就能尽可能地降低精子受损程度[4]。这种机械损伤主要受冷冻温度下降速度和速率的影响。因此，在冻精生产制作过程中，温度平衡要处于一个合理范围内[5]。

2.2 化学损伤

在精子内部，复杂的氧化还原体系维持着精子细胞内部各物质之间的相互作用。冷冻保存操作过程中，精子所处内环境发生巨大变化，活性氧（ROS）在体内是不可或缺的，是精子细胞正常生理代谢的产物，主要在细胞信号、线粒体功能和免疫等过程中发挥作用。但由于精子是高度分化的细胞，没有携带抗氧化物质的能力。在冷冻过程中，最容易受到损伤的就是精子质膜，并且精子膜的完整程度也直接影响精子受精能力[6]。在体外环境中，氧化还原平衡被打破，大量的ROS无法被反应中和，很容易与精子细胞膜上的磷脂发生氧化反应，破坏其结构，使细胞膜结构功能发生改变，从而导致精子的受精能力下降。此外ROS还会抑制酶类的活性[7]，导致其失活。不能尽快清除ROS，氧化损伤会造成精子运动性和受精能力受损，甚至破坏细胞核中的DNA[8]。

3 猪冻精保护剂研究与运用

3.1 糖类

3.1.1 红景天多糖

红景天多糖由中草药中提出，具有很强的抗氧化、抗衰老和抗细胞凋亡等作用。研究表明，红景天多糖可以清除超氧自由基，并且能有效地抑制脂质过氧化反应[9]。张树山等[10]实验表明，在猪精液冷冻过程中，添加红景天多糖冻后精子活力与活性有增强，最适宜量为6 mg/L，但用量过多有负面影响。添加红景天多糖后并且线粒体活性、顶体完整率、质膜完整率等多项指标都有明显改善。任子利[11]在藏猪精液冷冻保存实验中显示，在冷冻精液中添加红景天多糖不仅可以改善精液品质，同时可明显降低DNA甲基化的影响。

3.1.2 黄芪多糖

黄芪多糖是中药黄芪中的主要成分，抗氧化活性很好，在动物体内没有残留问题，且不会产生耐药性[12]。宋健等[13]在猪精液解冻复苏液中加入黄芪多糖，结果表明加入药品的实验组线粒体活性明显增加，对精子的穿卵率受精效果也有提升。李珣等[14]实验结果显示，精液冷冻前后，由于氧化反应破坏，过氧化酶活性以及mRNA表达均下降。添加黄芪多糖后，过氧化酶活性提高，精子抗氧化能力增强。

3.2 大豆卵磷脂

冷冻过程中，卵黄是保护精子免受低温打击的有效成分，在生产实践中也取得了很好的效果[15]。但由于动物源成分十分复杂，其安全性也一直被质疑。并且卵黄会与精子中一种蛋白凝固酶发生反应，对精子生存有不利影响。大豆卵磷脂是一种适合替代卵黄的植物性产品，普遍存在于哺乳动物的生物膜中[16]，可用于维持细胞膜结构的稳定性。汪俊跃[17]用大豆卵磷脂代替卵黄在猪精液冷冻保存效果实验结果显示，添加5%高压均质大豆卵磷脂可以替代卵黄在冷冻精液保存中的作用。

3.3 咖啡因

咖啡因是从咖啡、茶叶中提取出来的一种生物碱，在生物体中有提神，兴奋的作用。早在1978年就有咖啡因用于人类人工授精的实验[18]，同时对少精症患者精子活率有提高效果。郭雅欣[19]实验结果显示，冷冻过程中在4 ℃降温平衡过程中加0.2 g/L咖啡因，解冻后精子在体外存活时间明显增长，活力和活率均有显著改善。谷合勇[20]实验也有相似结果，咖啡因可以增加精子细胞对葡萄糖的氧化能力，为精子提供更多能量，加快精子的运动能力。