于弋涵，杜伟宁，胡秋辉，苏安祥，徐 辉，刘建辉，谢旻皓，杨文建,*

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室，江苏 南京 210023；2.南京外国语学校，江苏 南京 210018）

猴头菇（Hericium erinaceus）与鱼翅并称“山珍猴头、海味鱼翅”，不仅味道鲜美可口，还含有丰富的营养物质，其中蛋白含量丰富，是我国传统的食药两用真菌[1]。在猴头菇干制品中每100 g约含有27 g蛋白质，同时富含17 种氨基酸，其中包含有人体所必需的8 种氨基酸[2]。有研究利用蛋白组学和基因组学技术研究猴头菇中参与生物调节活性的蛋白，其中有722 种蛋白存在差异表达，有专家推测这些差异蛋白可能与分子信号传导、次级代谢和能量代谢等相关，这说明猴头菇生物合成基因的差异调控，使之产生了不同药理作用的活性代谢物质[3]。但目前对于猴头菇中活性物质的研究多在猴头菇多糖以及猴头菇醇浸提物和水浸提物方面[1]，对于猴头菇活性蛋白和活性肽的研究鲜有报道。

生物活性肽相较于蛋白质，具有更容易被人体吸收利用[4]、在较小浓度下具有较强的生物活性的特点[5]。近年来，国内外学者在食用菌活性肽研究方面取得了很大的进展。食源活性肽的制备大多是利用酶法水解，这种制备方法操作简单、成本低，被广泛用于工业制备[6-8]。在特定条件下，利用酶切出特定的片段，通过分离纯化技术可得到生物活性肽。程湛等[9]通过碱性蛋白、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、复合蛋白酶制备香菇多肽，发现复合蛋白酶酶解得到的香菇多肽具有较好的抗氧化和醒酒活性。李桂峰等[10]通过响应面设计优化木瓜蛋白酶酶解双胞菇的条件并获得具有抗氧化活性的双胞菇肽。张胜等[11]采用体外细胞培养研究灵芝活性肽的生物活性，结果发现灵芝活性肽对肝癌细胞具有抑制生长、促进凋亡的作用。除此之外，还有研究表明利用多种酶酶解茶树菇、松茸、滑菇、杏鲍菇等蛋白制备的生物活性肽具有多种生物活性[12-15]。由此看出食用菌中生物活性肽资源丰富，有很大的发展和挖掘潜能。

基于此，本研究利用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、风味蛋白酶对猴头菇蛋白进行酶解，探究体外抗氧化功能，并利用体外培养小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、人肝癌HepG-2细胞探究猴头菇多肽的抗炎和抗肿瘤活性，为猴头菇中生物活性肽的分离纯化制备提供基础信息，同时为猴头菇功能成分开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猴头菇（干制品） 黑龙江东宁北域良人山珍食品有限公司；碱性蛋白酶（2 000 U/mg）、胰蛋白酶（2 500 U/mg）、木瓜蛋白酶（6 000 U/mg）、风味蛋白酶（2 500 U/mg） 叶源生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2’-联喹啉-4,4’-二甲酸二钠（butyleyanoacrylate，BCA）试剂盒、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）（0.01 mol/L、pH 7.4） 北京索莱宝科技有限公司；高糖培养基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（foetal bovine serum，FBS）、青链霉素、胰蛋白酶 美国Gibco生物科技公司；NO测定试剂盒、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）试剂盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司；噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）检测试剂、白细胞介素（interleukin，IL）-6和IL-10酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunoadsordent assay，ELISA）试剂盒 南京建成生物工程研究所；小鼠单核巨噬细胞RAW264.7、人肝癌HepG-2细胞 上海瑞鹿生物技术有限公司；其他试剂（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

Tube Mill 100 control 磨粉机 艾卡（广州）仪器设备有限公司；TE2145电子天平 美国赛多利斯科学仪器有限公司；SB25-12超声清洗器 宁波新芝生物科技股份有限公司；HH-2恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；Academic超纯水系统 美国Millipore公司；GL-21M离心机 上海市离心机械研究所有限公司；L-8800氨基酸分析仪 日本Hitachi公司；FACSCalibur流式细胞仪美国Becton Dickinson公司；8000系列二氧化碳细胞培养箱 美国Thermo Fisher公司；SpectraMax M2e多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 猴头菇多肽的制备

猴头菇多肽的制备参考文献[16]。将猴头菇干制品利用磨粉机制备成猴头菇粉，过80目筛后按料液比1∶20加入蒸馏水，以0.1 mol/L NaOH溶液调至浸提液pH值为13，70 ℃水浴加热8 h，10 000 r/min离心20 min，取上清液。沉淀重复上述操作进行复提，合并2 次上清液，用0.1 mol/L HCl溶液调整上清液pH值为3，静置30 min，在12 000 r/min的条件下离心20 min，得到蛋白质沉淀。用少量超纯水搅匀蛋白，加入0.1 mol/L NaOH溶液调节至中性，后利用截留分子质量 500 Da、直径25 mm的透析袋透析10 h，透析外液为去离子水，每2 h更换一次透析外液。60 ℃旋蒸，体积浓缩至原体积三分之一后冷冻干燥，得到猴头菇粗蛋白备用。采用凯氏定氮法测定猴头菇粗蛋白中蛋白质量分数为71.43%。将猴头菇粗蛋白溶于水中（10 g/L）按照表1用0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L HCl溶液调节pH值并分别在木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶的作用下进行酶解，加酶量为0.1 g/L，酶解4 h后90 ℃加热10 min终止反应，12 000 r/min离心后取上清液进行冷冻干燥，得到猴头菇粗多肽分别命名为HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，置于室温干燥器中储存备用。

表1 蛋白酶最适水解条件Table 1 Optimum conditions for protease hydrolysis used in this study

1.3.2 猴头菇多肽氨基酸组成的分析

采用氨基酸自动分析仪测定猴头菇多肽氨基酸组成。称取1 mg的猴头菇多肽于安瓿管中，加入6 mol/L的浓盐酸，用保鲜膜封闭管口，在110 ℃下水解24 h后，将水解液全部转移至旋转蒸发仪内蒸干，用0.02 mol/L HCl溶液溶解并调节氨基酸浓度在40 nmol/L。采用氨酸酸自动分析仪进行氨基酸组分分析。

1.3.3 猴头菇多肽表面疏水性的测定

采用8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalene sulfonate，ANS）荧光探针法测定猴头菇多肽的表面疏水性[17]。将HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T溶于PBS（0.01 mol/L、pH 7.4，后同）配制成质量浓度为50、100、150、200、250 μg/mL的溶液。取4 mL样品溶液，加入20 μL 8 mmol/L ANS。荧光分光光度计测定样品的荧光强度（其中激发波长390 nm、发射波长470 nm），以样品质量浓度为横坐标，以荧光强度为纵坐标作图，拟合曲线初始阶段的斜率即为猴头菇多肽的表面疏水性指数。

1.3.4 猴头菇多肽抗氧化活性的测定

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的测定

在96孔板中分别加入50 μL质量浓度为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴头菇多肽或VC溶液，然后加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液混合均匀，其中空白为超纯水，对照为50 μL超纯水中加入200 μL 0.4 mmol/L DPPH-乙醇溶液。室温下，在黑暗中静置30 min后，通过酶标仪测定517 nm波长处的吸光度，按式（1）计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为对照的吸光度；A1为添加不同质量浓度猴头菇多肽或VC溶液的吸光度；A2为空白的吸光度。

1.3.4.2 •OH清除率的测定

准确吸取0.15 mL浓度5.0 mmol/L的邻二氮菲溶液加入试管中，再加入0.4 mL浓度0.75 mol/L PBS（pH 7.4）和0.25 mL蒸馏水，充分混匀。然后加入0.6 mL 7.5 mmol/L的FeSO4溶液后立即混匀。实验组试管中分别加入0.1 mL 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的猴头菇多肽或VC溶液，并加入0.1 mL体积分数1% H2O2溶液；空白组试管中加入0.1 mL的蒸馏水和0.1mL体积分数为1% H2O2溶液；对照组试管中加入0.2 mL的蒸馏水。各组溶液于37 ℃条件下保温60 min后冷却至室温，测定536 nm波长处吸光度。按照式（2）计算•OH清除率。

式中：A1为对照组吸光度；A2为实验组吸光度；A3为空白组吸光度。

1.3.5 猴头菇多肽对RAW264.7细胞抗炎活性的测定

1.3.5.1 RAW264.7细胞的培养

RAW264.7细胞用完全培养基（含体积分数10% FBS和体积分数0.5%青链霉素的DMEM培养基）在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期进行传代。当细胞铺板率大于培养瓶底面积的80%时，吸尽原培养基并用移液枪吸取3 mL PBS，洗涤细胞两次，除去漂浮的死细胞，随后用移液枪吸取2 mL完全培养基吹打细胞至完全脱落，调整细胞悬液浓度为1×104个/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于细胞培养箱中孵育24 h。

1.3.5.2 RAW264.7细胞增殖率的测定

使用MTT法评估猴头菇多肽对RAW264.7细胞的毒性[18]。1.3.5.1节96 孔板中RAW264.7细胞37 ℃孵育24 h后吸尽培养液，用PBS洗涤数次。空白组加入200 μL的DMEM，对照组（不含RAW264.7细胞）加入200 μL/孔DMEM，实验组加入200 μL/孔含400 μg/mL猴头菇多肽的DMEM，每组设置5 个平行，孵育24 h后，加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL）并在37 ℃培养基中孵育4 h。去除MTT溶液后每孔加入100 μL DMSO。将96 孔板置于恒温振荡器上室温振荡20 min后，测定570 nm波长处的吸光度，按照式（3）计算细胞增殖率。

式中：A1为实验组吸光度；A0表示对照组吸光度；A2表示空白组吸光度。

1.3.5.3 NO浓度的测定

采用Griess法对RAW264.7细胞的NO释放量水平进行测定[19]。将1.3.5.1节96 孔板中RAW264.7细胞，孵育24 h，去除上层培养液。96 孔板中加入100 μL 10 μg/mL的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），放置在培养箱中孵育4 h后加入100 μL不同质量浓度（0、50、100、200、400 μg/mL）的样品，培养24 h，收集上清液并参考NO测定试剂盒说明书测定NO浓度。

1.3.5.4 IL-6、IL-10质量浓度的测定

参考ELISA试剂盒说明书测定RAW264.7细胞IL-6、IL-10质量浓度。

参照1.3.5.3节方法建立炎症模型，即用10 μg/mL LPS处理RAW264.7细胞4 h后移除上清液。实验组加入不同质量浓度的猴头菇多肽（50、100、200、400 μg/mL），空白组加入完全培养基，孵育24 h。每组样品设置5 个平行。

1.3.6 猴头菇多肽抑制HepG-2细胞活性的测定

1.3.6.1 HepG-2细胞的培养

HepG-2细胞用完全培养基置于5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养，待细胞生长至对数生长期进行传代。当细胞铺板率大于培养瓶底面积的80%时，吸尽原培养基并用移液枪吸取3 mL PBS，洗涤细胞两次，除去漂浮的死细胞，随后用移液枪吸取2 mL胰蛋白酶溶液（质量分数0.25%，后同），覆盖细胞约30 s后吸去胰蛋白酶溶液，培养箱放置2 min后加入2 mL完全培养基吹打细胞至完全脱落，调整细胞悬液浓度为1×104个/mL，按每孔100 μL加入到96 孔板中，置于细胞培养箱中孵育24 h。

1.3.6.2 HepG-2细胞增殖率的测定

将1.3.6.1节96 孔板中HepG-2细胞37 ℃孵育24 h后吸除培养液，用PBS洗涤数次。参照1.3.5.2节方法测定HepG-2细胞在200 μg/mL猴头菇多肽、50 μg/mL5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-Fu）（阳性对照组）作用下的HepG-2细胞增殖率。

1.3.6.3 乳酸脱氢酶释放率的测定

将1.3.6.1节96 孔板中HepG-2细胞，孵育24 h后去除上层培养液。分别用不同质量浓度的样品（50、100、200、400 μg/mL）处理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作为阳性对照组，等体积的DMEM为空白组，不含细胞的等体积DMEM为对照组。培养结束后，小心吸取孔内上清液，利用LDH检测试剂盒检测上清液中LDH水平。按照式（4）计算LDH释放率。

式中：A1为空白组吸光度；A0为对照组吸光度；A2为添加样品的实验组吸光度。

1.3.6.4 MDA含量的测定

通过硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法[20]测定HepG-2细胞内MDA含量。将1.3.6.1节96 孔板中HepG-2细胞，孵育24 h后去除上层培养液。分别用不同质量浓度的样品（50、100、200、400 μg/mL）处理12 h，以50 μg/mL 5-Fu作为阳性对照组，等体积的培养基为空白组。培养结束后，吸弃上清液。加入100 μL细胞裂解液裂解细胞，裂解完成后，10 000×g离心10 min，取上清液后参考MDA试剂盒说明书测定各组HepG-2细胞中MDA含量，单位为U/mg。

1.3.6.5 流式细胞仪测定细胞凋亡

使用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒对HepG-2细胞凋亡状况进行测定。按照1.3.6.1的方法培养HepG-2细胞，细胞培养结束后，收集细胞培养液，用PBS洗涤细胞，然后加入0.5 mL胰蛋白酶溶液。室温孵育2 min，吸除胰蛋白酶溶液，加入收集的细胞培养液，吹打细胞，移至离心管，1 000×g离心5 min，弃去上清液，收集细胞，用PBS重悬细胞并计数，取5×104个重悬的细胞，1 000×g离心5 min，弃去上清液，依次加入195 μL的Annexin V-FITC结合液，5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液，混匀。室温避光孵育15 min后，待测液保存于冰盒中。使用流式细胞仪测定细胞凋亡量，检测前需轻轻重悬细胞，用FlowJo软件分析流式细胞仪检测结果。

1.4 数据处理与分析

数据以3 次测定结果的平均值±标准差表示，所得数据使用SPSS 20.0软件进行处理和分析，采用Duncan检验进行显著性统计分析，以P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。采用Origin 8.5软件绘图。

2 结果与分析

2.1 不同的猴头菇多肽氨基酸组成

活性肽的功能取决于其特殊的氨基酸以及排列顺序，有研究表明，谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、酪氨酸、蛋氨酸等有利于提高活性肽的抗氧化活性，具有较强的自由基清除活性，除此之外，疏水性氨基酸可以增强肽与脂类的相互作用更易于进入靶细胞发挥抗炎与抗癌细胞活性[21]。因此，不同的氨基酸组成对活性肽发挥生物活性至关重要。本实验对4 种猴头菇多肽进行氨基酸分析结果如表2所示，4 组酶解物的氨基酸组成都富含谷氨酸、脯氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸和蛋氨酸，这些氨基酸都有助于增强其抗氧化作用。HEPH-A和HEPH-T的必需氨基酸含量最高，为132.11 mg/g和141.38 mg/g，表明猴头菇多肽具有较好的营养价值，此外疏水性氨基酸含量也均高于另外两组，表明它们更容易进入细胞发挥作用。

表2 猴头菇多肽的氨基酸组成及含量Table 2 Amino acid composition of HEPHs

续表2

2.2 不同猴头菇多肽的表面疏水性指数

在天然蛋白质分子中，疏水基团埋藏在其折叠结构内，蛋白质被水解后就会暴露这些基团，表现在其表面疏水性的增加，而随着水解程度的加剧，暴露的基团又会被水解成更小的肽段，甚至是氨基酸，从而失去其表面疏水性[22]。研究认为活性肽的疏水性结构会显著影响抗氧化活性，活性肽N-端的疏水残基也有助于提高抗氧化的作用[23]。由图1可知，HEPH-A具有较高的表面疏水性指数（1 256.67±5.37），其次为HEPH-P（1 113.90±3.48）。表明HEPH-A和HEPH-P可能含有与抗氧化活性相关的活性肽。

图1 不同猴头菇多肽的表面疏水性指数Fig. 1 Hydrophobicity indices of HEPHs

2.3 不同猴头菇多肽的抗氧化活性

DPPH自由基作为相对稳定的自由基被广泛用来检测以自由基捕获剂或氢供体形式存在的物质，从而用以评定其抗氧化能力[24]。大量的生化反应会生成超氧阴离子，虽然它们不能直接引起脂肪氧化，但是能与•OH发生反应，对机体的危害极大[25]。因此本实验考察了猴头菇多肽对DPPH自由基和•OH的捕捉能力。如图2A所示，随着样品质量浓度升高，DPPH自由基清除率不断升高，1.0 mg/mL HEPH-P的DPPH自由基清除率达到（53.01±0.27）%，尽管低于VC的DPPH自由基清除率（（96.63±0.27）%），但仍显示出较高的DPPH自由基清除活性，说明HEPH-P中含有与DPPH自由基清除相关的活性肽组分。如图2B所示，不同猴头菇多肽的•OH清除率随浓度上升而升高，其中1.0 mg/mL HEPH-P的•OH清除率（（55.73±1.52）%）大于其他猴头菇多肽，表现出较好的•OH清除效果。这与图2A的DPPH自由基清除率结果是一致的，表明HEPH-P中含有与抗氧化相关的活性肽组分。此结果与梁杰等[26]研究中木瓜蛋白酶可以水解出具有抗氧化活性多肽的结果是一致的。

图2 猴头菇多肽的DPPH自由基清除活性（A）和·OH清除活性（B）Fig. 2 DPPH (A) and hydroxyl radical (B)-scavenging activity of HEPHs

2.4 不同猴头菇多肽对RAW264.7细胞抗炎活性的影响

2.4.1 不同猴头菇多肽对RAW264.7细胞增殖率的影响

细胞增殖率可用来测定细胞生长分裂情况，常用来表征样品对细胞活性的影响[27]。选取高剂量400 μg/mL对小鼠巨噬细胞RAW264.7进行细胞毒性测定，结果如图3所示。经HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T处理后，RAW264.7细胞的细胞增殖率分别为（108.20±1.20）%、（103.94±1.23）%、（115.35±2.06）%、（90.28±1.24）%，均高于80%，表明猴头菇蛋白水解物作用质量浓度不高于400 μg/mL时，对小鼠巨噬细胞的毒性作用低，可用于进行细胞实验。

图3 不同猴头菇多肽对RAW264.7细胞增殖率的影响Fig. 3 Effect of HEPHs on RAW264.7 cell viability

2.4.2 不同猴头菇多肽对RAW264.7细胞NO分泌的影响

有研究报道NO参与免疫应答相关的生理过程，是巨噬细胞杀伤病原微生物的主要效应分子之一[28]。过量持续刺激产生的NO和促炎因子会引起细胞的炎症反应，导致细胞的损伤和凋亡[29]。RAW264.7细胞经LPS刺激后过量表达NO，而细胞内过多的NO不利于缓解炎症反应。因此对经过不同猴头菇多肽处理后RAW264.7细胞上清液中NO进行测定，结果如图4所示。HEPH-A处理组和HEPH-T处理组细胞中的NO释放量减少，并且随着样品浓度的升高，与空白组相比，处理组NO浓度极显著降低（P＜0.01）。其中，在400 μg/mL HEPH-A处理后的细胞NO浓度为（29.23±1.46）μmol/L，极显著低于空白组（（53.12±1.26）μmol/L）（P＜0.01），且明显低于其他猴头菇多肽处理组，表现出较好的抑制NO产生的效果。由此表明，HEPH-A处理可以有效降低NO分泌，表现出较强的抗炎活性，因此选择HEPH-A进行后续实验。

图4 不同猴头菇多肽对RAW264.7NO释放量的影响Fig. 4 Effect of HEPHs on RAW264.7 NO release y

2.4.3 HEPH-A对RAW264.7细胞IL-6、IL-10分泌的影响

巨噬细胞激活后可通过分泌细胞因子传导并调控免疫通路，其中IL-6、IL-10在其中发挥着重要的作用。有研究表明IL-6能促进原始骨髓源细胞的生长和分化、增强自然杀伤细胞的裂解功能，但是IL-6持续分泌会对细胞产生损伤，加速炎症反应的发展；而IL-10可以抑制炎性细胞的激活、迁移和黏附，缓解炎症反应，并在组织修复、过敏反应过程中发挥作用[30]。根据2.4.2节结果，选择猴头菇多肽HEPH-A，进一步探究其在LPS刺激炎症模型中IL-6、IL-10的分泌水平。为了研究HEPH-A对细胞炎症抑制作用是否通过调控细胞因子的分泌而实现，采用不同质量浓度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）处理RAW264.7细胞后测定细胞IL-6和IL-10的水平，空白组采用等体积的PBS处理，结果发现IL-6质量浓度分别达到（153.04±1.93）、（153.11±1.95）、（139.25±1.66）、（129.85±1.32）ng/mL，空白组为（156.19±1.29）ng/mL（图5）。与空白组相比，200、400 μg/mL HEPH-A处理RAW264.7细胞的IL-6的分泌量极显著降低（P＜0.01），说明在一定剂量下HEPH-A可显著抑制炎症因子IL-6的分泌。不同质量浓度HEPH-A（50、100、200、400 μg/mL）处理后IL-10质量浓度分别为（183.92±1.32）、（200.75±1.62）、（251.40±1.39）、（302.36±1.14）ng/mL，空白组为（359.62±1.31）ng/mL，说明高剂量HEPH-A能有效促进IL-10释放，并且400 μg/mL HEPH-A处理RAW264.7细胞的IL-10的分泌水平最高。综上，HEPH-A可以通过抑制IL-6的分泌、促进抑炎因子IL-10的释放而缓解炎症反应。

图5 猴头菇多肽HEPH-A对RAW264.7细胞中IL-6（A）、IL-10（B）水平的影响Fig. 5 Effect of HEPH-A on the secretion of IL-6 (A) and IL-10 (B) in RAW264.7 cells

2.5 不同猴头菇多肽对HepG-2细胞的影响

2.5.1 不同猴头菇多肽对HepG-2细胞活力影响

MTT法是一种检测细胞存活及生长情况的方法，能直接反映细胞状态。为了验证猴头菇蛋白4 种水解后猴头菇多肽（HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A及HEPH-T）的体外抗肿瘤活性，利用MTT法研究猴头菇多肽在（200 μg/mL）对HepG-2细胞增殖抑制作用。结果如图6所示，空白组细胞增殖率为100%，阳性对照组（50 μg/mL 5-Fu）细胞增殖率为（60.02±1.25）%。与空白组相比，HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A组细胞增殖率极显著下降（P＜0.01），其中HEPH-P组最低，为（72.14±1.40）%，高于阳性对照组。由此可见，HEPH-P、HEPH-F和HEPH-A能够极显著抑制HepG-2细胞增殖（P＜0.01），其中HEPH-P的抑制效果最好，因此选择HEPH-P进行后续实验。

图6 猴头菇多肽不同组分对HepG-2细胞活力的影响Fig. 6 Effect of HEPH on cell viability of HepG-2 cells

2.5.2 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞LDH释放的影响

已有研究证明HepG-2肝癌细胞增殖被抑制的原因可能是活性物质促使肝癌细胞细胞膜发生破裂导致细胞死亡。而LDH是一种随着细胞膜破裂会释放到膜外的酶，其活力能够反映细胞膜完整性破坏程度[31]。如图7所示，将HEPH-P以不同质量浓度（50、100、200、400 μg/mL）作用HepG-2细胞后，细胞中LDH释放率分别为（108.06±2.35）%、（120.83±2.60）%、（137.36±2.44）%、（149.97±3.25）%，阳性对照组LDH释放率为（204.34±1.61）%，均极显著高于空白组（P＜0.01）。HEPH-P作用于HepG-2细胞后使细胞膜发生破裂，LDH被释放，导致细胞死亡。LDH的释放率随添加HEPH-P质量浓度增加而上升，这与李娜等[32]的研究结果是一致的。

图7 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞中LDH释放率的影响Fig. 7 Effect of HEPH-P on LDH release in HepG-2 cells

2.5.3 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞MDA含量的影响

MDA是脂质氧化的终产物之一，其含量主要反映HepG-2细胞过氧化的程度，也间接反应细胞的损伤程度[33]。如图8所示，200 μg/mL HEPH-P处理HepG-2细胞中MDA的含量为（25.98±4.56）U/mg，极显著高于空白组（P＜0.01）。这与2.5.2节的结果并不矛盾，表明HEPH-P导致细胞膜破裂，细胞内容物外泄导致大量氧化反应，导致MDA含量升高。

图8 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞中MDA含量的影响Fig. 8 Effect of HEPH-P on MDA content in HepG-2 cells

2.5.4 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞凋亡的影响

为了探究由HEPH-P是否会引起HepG-2细胞的凋亡，使用流式细胞仪分析了凋亡细胞的百分比[34-35]。如图9所示，HEPH-P可显著促进凋亡期HepG-2细胞的积累，与空白组（0.28%）相比，400 μg/mL HEPH-P组凋亡细胞比例增加到81.4%，其中早期凋亡细胞比例和晚期凋亡细胞比例分别为80.5%和0.9%。由此可知，HEPH-P处理可以显著诱导HepG-2细胞凋亡，且主要是早期凋亡。促使细胞凋亡是活性肽发挥抗肿瘤生物活性的重要途径之一，上述结果表明HEPH-P诱导了HepG-2细胞凋亡。

图9 猴头菇多肽HEPH-P对HepG-2细胞凋亡的影响Fig. 9 Effect of HEPH-P on HepG-2 cell apoptosis

3 结 论

本研究通过对猴头菇蛋白进行酶解制备猴头菇多肽HEPH-P、HEPH-F、HEPH-A、HEPH-T，其中HEPH-P的DPPH自由基清除率和•OH清除率均高于其他猴头菇多肽，具有较好的抗氧化活性，同时在HepG-2细胞中能够抑制癌细胞增殖，具体表现在促使细胞膜破裂、LDH释放以及细胞凋亡，从而抑制癌细胞增殖。除此之外，HEPH-A在体外RAW264.7抗炎模型中表现出抗炎活性，经400 μg/mL HEPH-A处理后，小鼠巨噬细胞RAW264.7 NO分泌量由空白组（53.12±1.26）μmol/L降低为（29.23±1.46）μmol/L，IL-6的释放减少，IL-10的分泌增加。综上，木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶水解猴头菇蛋白得到的猴头菇多肽具有较好的抗氧化、抗癌和抗炎活性，本实验揭示了猴头菇生物活性肽的生物活性，为猴头菇生物活性肽的制备和应用提供了理论参考。