郭佩佩，王长琛，黄鑫，潘博

(中国医学科学院北京协和医学院整形外科医院整形七科，北京 100144)

脊椎动物的颅面部器官发育过程十分复杂，其形态发生包含骨、软骨、结缔组织等不同细胞类型的发育。有研究报道，颅面畸形是人类最常见的出生缺陷之一，1/3的先天性出生缺陷由颅面畸形引起[1]。颅面部畸形主要发生在妊娠前3个月，这是脊柱动物高度保守的发育窗口。多种信号通路和基因，如成纤维细胞生长因子信号通路、音猬因子(sonic hedgehog，SHH)信号通路、骨形态发生蛋白信号通路以及同源异型盒基因(homeobox genes，HOX)、转录因子性别决定区Y框相关基因(sex determining region Y-box gene，SOX)等，在神经嵴细胞的诱导、迁移、增殖和分化过程中均发挥至关重要的作用，这些因子任意时间空间的特异性表达失调均会影响细胞的发育，从而影响正常器官形态的形成[2-3]。视黄酸是维生素A的活性代谢产物，通过结合受体调节多个靶基因的表达，以调控神经嵴细胞的发育[4]。视黄酸通路调控紊乱可引起颅面部多种先天性畸形的发生。现就近年来有关视黄酸信号通路与颅神经嵴细胞发育关系的研究进展予以综述，进一步阐述视黄酸信号通路与颅面部器官发育缺陷的关系，以期为今后的研究提供参考。

1 视黄酸信号通路

视黄酸是维生素A在生物体内的代谢产物。维生素A主要存在于动物性食品(如肉和奶制品)中，橙色蔬菜中的胡萝卜素也可以被分解为维生素A。根据视黄酸分子结构中极性基团及侧链的不同，其可分为多种同分异构体，包括全反式视黄酸、9-顺式视黄酸、13-顺式视黄酸等。全反式视黄酸是体内典型视黄酸通路中的生物学活性形式[5]；9-顺式视黄酸也是体内具有生物学活性的形式；13-顺式视黄酸又被称为异维A酸，是皮肤科的常用药物。视黄酸参与胚胎发育过程中的一系列生理过程，包括细胞增殖、凋亡和分化等，对成体动物的神经、骨骼、血液及免疫系统等稳态的维持有重要影响[4,6-7]。

视黄酸是一种脂溶性分子，在胚胎发生过程中由母体视黄醇产生。母体来源的视黄醇与视黄醇结合蛋白4结合后通过视黄酸诱导蛋白6进入细胞。视黄酸诱导蛋白6是一种膜转运体，负责结合并运送视黄醇-视黄醇结合蛋白复合体穿过细胞膜进入靶细胞内。被细胞摄取后的视黄醇与细胞内的视黄醇结合蛋白结合后通过两步反应生成视黄酸[8]。第一步的氧化反应由具有醇脱氢酶活性的酶催化产生视黄醛，此步骤主要通过短链脱氢酶家族的酶和中链脱氢酶家族的酶参与完成。第二步由视黄醛脱氢酶(retinaldehyde dehydrogenases，RALDH)将视黄醛氧化为视黄酸，这是影响视黄酸合成的限速步骤。共有4种RALDH在视黄酸的合成过程中具有重要作用，其中RALDH1、RALDH2和RALDH3参与全反式视黄酸的合成，而RALDH4参与体内9-顺式视黄酸的合成。研究表明，RALDH2是早期脊椎动物胚胎中此步骤的最主要参与者，在胚胎原肠胚时期即可检测到[9]。细胞内产生的视黄酸主要经历以下3种不同的生理过程。如果细胞内有细胞色素氧化酶P450家族26亚家族(cytochrome P450 26 subfamily，CYP26)的酶类，视黄酸就会在胞质中被羟基化，形成生物活性较低的极性代谢物，最终从细胞中清除。CYP26A1、CYP26B1和CYP26C1三个成员是体内重要的视黄酸降解酶[5]。RALDH和CYP26分别具有合成和分解视黄酸的作用，并共同调控维持机体内视黄酸的稳态。若细胞中没有CYP26，视黄酸则进入细胞核，与胞核内的受体结合，触发靶基因的转录激活。视黄酸的核受体包含视黄酸受体(retinoic acid receptor，RAR)和视黄酸Ⅹ受体(retinoid Ⅹ receptor，RXR)[10]。脊柱动物的RAR和RXR均有α、β和γ亚型，每种亚型都有相应的同分异构体，并在不同组织或细胞中发挥作用。全反式视黄酸、13-顺式视黄酸可与RAR结合，而9-顺式视黄酸则可以与两种受体结合。RAR和RXR可组成异构二聚体RAR-RXR受体，在缺乏视黄酸的情况下，RAR-RXR受体与靶基因启动子区域的视黄酸反应元件结合，招募组蛋白脱乙酰基和阻遏蛋白抑制靶基因转录；当视黄酸存在时，视黄酸与受体结合并使其构象发生改变，释放阻遏蛋白并暴露出共激活因子结合位点，促进靶基因的转录[11]。一个细胞中产生的视黄酸还可通过旁分泌的方式向邻近细胞发出信号，介导非细胞自主效应。

2 视黄酸在神经嵴细胞发育中的作用

神经嵴细胞是脊椎动物特有，起源于背侧神经管的一组可迁移的多潜能干细胞。颅神经嵴细胞是神经嵴细胞的一个子集，在颅面结构的形成中起重要作用，构成颅面部大多数组织结构的细胞均由颅神经嵴细胞衍生而来，包括神经元细胞、肌成纤维细胞、黑素细胞、胶质细胞、软骨细胞和骨细胞等[12-13]。颅神经嵴细胞的诱导、迁移、增殖、分化均需要严格时空信号网络的调控，任何涉及调节颅神经嵴细胞行为的信号失调均可能导致颅面畸形的发生。

在原肠胚时期，神经嵴细胞位于神经板边缘和非神经外胚层之间，通过上皮-间充质转化在神经沟背侧中线聚集形成神经管，并与神经上皮分离[14]。神经嵴细胞的诱导过程需要神经外胚层和非神经外胚层以及下层近轴中胚层之间信号的相互作用。而神经嵴细胞最早的标志物，也是其诱导过程所必需的转录因子Gbx2则由包括视黄酸在内的信号分子诱导产生[4,15]。视黄酸还参与脊椎动物神经管发育的前后轴模式的形成。在胚胎原肠胚时期和早期体细胞形成时期，给予胚胎外源性视黄酸可以改变HOX编码，并干扰神经管前后模式的形成，破坏神经嵴细胞的诱导过程[16-17]。

诱导并进行上皮-间充质转化后的颅神经嵴细胞可从间脑、中脑和菱脑(又称后脑)部位沿特定路径向腹侧区域进行广泛而协调的运动。起源于间脑和中脑前部的颅神经嵴细胞迁移至额鼻突并分化为鼻部、眼部、额骨和一部分上颌结构。敲除视黄酸受体小鼠的神经嵴细胞存活异常，导致不同程度的额骨、上颌骨和蝶骨融合缺陷等面中部发育不全表型出现[18]。视黄酸信号通路还通过对抗成骨因子的调节来调控成骨机制。外源性视黄酸可以改变成骨和破骨细胞之间的平衡，导致颅骨增厚[19]。

成对同源异型结构域蛋白转录因子2是哺乳动物眼球发育的调控因子，其蛋白表达是神经嵴细胞正常迁移所必需[20]。在早期迁移的神经嵴细胞中，视黄酸信号通路增加或成对同源异型结构域蛋白转录因子2表达下调会导致神经嵴细胞凋亡及迁移的抑制，而抑制视黄酸的生物合成或过表达成对同源异型结构域蛋白转录因子2也会干扰神经嵴细胞的迁移，导致眼结构及颅面发育的异常。外源性视黄酸处理胚胎可以改善过表达成对同源异型结构域蛋白转录因子2a而引起的神经嵴迁移抑制和细胞凋亡[16]。

起源于中脑后部和菱脑的颅神经嵴细胞迁移到特定的腮弓。成纤维细胞生长因子信号通路和Wnt信号通路通过调控Cyp26的时间和空间表达，使视黄酸在菱脑部位形成一个前后表达不一的浓度梯度，引导着颅神经嵴细胞的迁移[21-22]。鳃弓发育于咽两侧，内侧包绕内胚层，外部覆以外胚层的上皮，能够产生大量的颅面头颈部结构。位于第一鳃弓的颅神经嵴细胞衍生为面部的上颌和下颌骨。上颌骨的形成依赖于成纤维细胞生长因子8介导的远端缺失同源盒1的表达[23]，而下颌骨受内皮素-1诱导的远中缺失同源盒基因5和远中缺失同源盒基因6的表达调控[24]。神经嵴诱导分层后的外源性视黄酸治疗减少了鳃弓内成纤维细胞生长因子8和内皮素-1的表达，从而抑制上下颌骨结构的发育[25-26]。颅神经嵴细胞迁移分化为第二到第四鳃弓的过程由HOX家族基因表达决定，而视黄酸是菱脑中HOX基因的关键调控因子。如HOXA2在确定第二鳃弓方面起着至关重要的作用，而第三鳃弓的发育则与HOXA3的水平密切相关[27-28]。HOXA2的敲除或表达下调使第二鳃弓向第一鳃弓转变，导致舌骨的丢失和第一鳃弓衍生的上下颌结构的重复。妊娠早期HOXA2表达失调会导致外耳道复制和耳廓缺失，而胚胎晚期HOXA2表达失调会导致耳廓位置降低[29]。在原肠胚和早期体细胞形成期间，给予胚胎外源性视黄酸会改变HOX编码，正常鳃弓结构的形成被破坏，导致神经嵴衍生结构的畸形[30-31]。

3 视黄酸信号通路调节紊乱造成的颅面部发育畸形

胚胎内的视黄酸依赖于母体供应，其浓度的异常降低或升高均会导致胚胎先天性颅面表型的异常。胎儿体内视黄酸浓度的降低会导致小头畸形、唇裂、腭裂和小眼症等。而母体摄入过量维生素A或暴露于视黄酸类似物也会导致小耳畸形、眼距过宽、小颌畸形、唇裂和腭裂等。视黄酸水平严重异常甚至会导致胚胎死亡。

3.1腭裂 在腭板的发育过程中，过量的视黄酸暴露会导致腭裂的发生。小鼠胚胎发育的第8.5天是颅神经嵴细胞形成及迁移的时期，此时的视黄酸暴露可引起腭裂的发生。与胚胎的其他时期相比，胚胎第8.5天发生视黄酸暴露小鼠的腭裂发生率更高[32]。SHH信号通路的调控在腭突的生长发育模式形成过程中起着至关重要的作用。补充外源性视黄酸的胚胎腹侧前脑区域的SHH信号显著减少，使位于第一鳃弓的颅神经嵴细胞发生凋亡，进而导致腭裂及腭皱襞形态异常的发生。而通过化学激动剂恢复SHH信号可以减少颅神经嵴细胞的凋亡，并降低腭裂的发生率[33-34]。对小鼠腭裂模型的研究表明，在腭上皮细胞和腭突间充质细胞中，SHH信号通路通过抑制视黄酸的活性来维持正常的组织发育。在Shh基因条件性敲除的腭上皮细胞和腭突间充质细胞中，视黄酸降解的生理过程被抑制，导致腭突和腭皱襞的发育异常[11]。另有研究报道，外源性视黄酸可能通过抑制Smad信号通路的激活来影响腭突间充质细胞增殖，导致腭裂的发生[35]。

3.2胎儿酒精谱系障碍 胎儿酒精谱系障碍指因妊娠女性在妊娠期间摄入乙醇而导致胎儿出现的一组解剖畸形和神经发育异常，其颅面部特征表现为上唇薄、人中平滑或长、睑裂短、鼻梁低等。胎儿酒精综合征是胎儿酒精谱系障碍疾病中较严重的类型，除上述特征性表型外，约60%的胎儿酒精综合征患儿存在小头畸形[36-37]。体内的乙醇代谢产物可产生一系列影响胎儿正常发育的作用，如正常DNA甲基化模式改变、微RNA改变、细胞黏附、连接的变化以及多种生长信号转导分子表达的改变等[38-40]。故推测，乙醇清除和视黄酸生物合成之间的酶竞争是产前乙醇暴露导致面部及小头畸形的重要原因之一[8]。乙醇的氧化产物乙醛是RALDH2的有效底物。乙醛与视黄醛竞争RALDH2的酶活性区域，从而使视黄醛积累，视黄酸合成减少，最终导致胚胎发育过程中的颅面畸形[36]。在动物实验中，乙醇暴露母体在补充维生素A或其代谢产物后，其体内视黄酸信号通路相关基因的表达水平部分或全部恢复，在一定程度上防止了胚胎组织器官的发育畸形[41-42]。

3.322q11.2微缺失综合征 22q11.2微缺失综合征是人类最常见的一类临床症候群，以第22号染色体长臂上1.5 Mb～3 Mb的杂合缺失为遗传学基础[43]。22q11.2微缺失综合征突出的临床表现包括颅面畸形、先天性心脏病、腭裂、胸腺发育不全、免疫缺陷以及喂养困难、认知、行为缺陷等。TBX1是22q11.2微缺失综合征最重要的候选基因。在鳃弓的发育过程中，TBX1受到视黄酸的调控。小鼠体内TBX1突变导致RALDH2表达异常及Cyp26表达下调，视黄酸水平升高引起鳃弓发育缺陷，导致颅面和心脏畸形[22]。在胚胎发育中，视黄酸诱导蛋白6表达于多种组织，包括鳃弓上皮。人类视黄酸诱导蛋白6基因突变导致眼部结构缺陷、腭裂、耳畸形等多种颅面器官畸形，并可导致与22q11.2微缺失综合征相似的表型，如心脏和认知行为发育缺陷等[44]。

3.4CHARGE综合征 CHARGE综合征是CHD7基因杂合突变引起的一类先天性多器官畸形综合征，主要症状包括眼畸形、心脏畸形、后鼻孔闭锁、生长发育迟滞、生殖器发育不全、耳畸形及听力障碍等[45]。在胚胎发育过程中，视黄酸信号的失调会导致类似于CHARGE综合征的发育缺陷。而视黄酸生物合成抑制剂可以修复CHD7敲除小鼠的内耳畸形[46]。有研究表明，CHD7作用于视黄酸合成酶RALDH3的上游，可直接调控其表达，而RALDH3基因的缺失可部分挽救CHD7突变小鼠的内耳缺陷表型[47]。

3.5胎儿寨卡综合征 通过母婴传播而引起的先天性寨卡病毒感染会引起胎儿一系列功能和结构的先天缺陷，称为胎儿寨卡综合征，包括癫痫发作、先天性挛缩、椎体外系病变、宫内生长发育受限、颅面及小头畸形等[48]。有学者在寨卡病毒基因组中发现了与视黄酸反应元件一致的序列，并推测这些病毒的罕见序列与细胞核中的RXR-RAR异源二聚体结合，导致视黄酸信号减少，并干扰了胚胎发育期间正常的基因调控，引起胎儿寨卡综合征中的小头畸形表型[49]。

4 小 结

脊椎动物颅面器官的发育是一个十分复杂的过程，涉及不同阶段、不同空间的多种信号分子与周围组织间的协调作用。视黄酸信号通路对于胚胎正常发育，特别是颅面部器官的发育具有重要作用。在颅神经嵴细胞诱导、迁移及分化成颅面部各种突起的过程中，视黄酸信号通路的相关分子突变或表达异常均可能阻碍神经嵴细胞的活动，造成颅面组织形态的发育缺陷。目前有关视黄酸通路在颅面器官形态发生过程发挥作用的具体机制的研究仍处于探索阶段。