谢 薇

中药为我国中医学必需的治疗方法，在保健、养生、治疗疾病等方面起到不可替代的作用。分子鉴定技术逐渐成为中药鉴定的主要鉴定方法，是通过直接分析遗传物质的多态性以推断物种内遗传变异情况，以实现药材鉴定的方法[1]。本文对分子标记技术分析和总结了该方法的优缺点，并阐述了分子鉴定技术未来发展方向。

1 分子标记技术的分类

分子鉴定技术分为：以mDNA为基础的分子标记技术、基于传统Southern印迹杂交技术的分子标记、以PCR为基础的分子标记技术、以重复序列为基础的分子标记技术、DNA序列分析、DNA条形码技术[2]。

1.1 以RP-PCR为基础的标记技术以RP-PCR为基础具有操作简便、敏感性高、特异性强、高通量等优点，其主要引用在遗传多样性分析和对中药材快速鉴定中，存在的缺点为无法避免基因组DNA、定量准确性弱、并且鉴定的误差较大[3]。

1.2 Southern杂交技术的标记技术主要为RFLP、单链多态性RFLP、变性梯度凝胶电泳-RFLP技术等，具有标记数目无限、大部分标记具有明显性、任何生育期可进行预测、不受到外部环境的影响且存在高度的变异性，多用于中药的多样性分析和品种鉴定分析，存在缺点为准确性较差、容易产生假现象[4]。

1.3 以重复序列为基础的标记技术主要有DNA重复序列应用于ISSR技术，为DNA微基础的分子标记，其原理为用锚定的DNA为引物，在PCR反应中可是锚定引物引起特定位点退火锚定引物互补和不太重复序列的DNA片段，开展PCR扩增，可扩增为多个条通过聚丙烯酞胺凝胶电泳进行分辨，以发生显性反应[5]。

1.4 以mDNA为基础的标记技术主要为逆转录PCR、差异显示、差异显示逆转录PCR、特征性差异明显，其中RT-PCR技术比较广泛，是PCR广泛应用的变形形式[6]。一条RNA链被逆转录为相互补充的DNA，并通过PCR模板进行DNA扩增。

1.5 DNA条形码技术的标记技术主要优点为不受形态特征和生物个体发育的限制、检测样本的范围较广，检测具有高效、准确、实现自动化和标准化的优势。主要应用于品种鉴定、指纹图谱构建、遗传育种及多样性分析方面的鉴别[7]。该种鉴别方法的缺点为不能对药材具有的DNA差异进行烙印。

2 分子标记技术的应用

分子鉴定技术在中药鉴定中主要表现为多基原鉴定、遗传多样性、正品替代品鉴定、真伪鉴定、产地鉴定及年限鉴别等。

2.1 多基原鉴定应用分子鉴定技术鉴定中药基原的研究，贝母、黄芩、太子参、枇杷通过ISSR技术进行遗传多样性鉴定，溪黄草可通过RAPD技术进行鉴定[8]。相关研究通过比较商品沉香、白木香、人工诱导沉香为材料，将醇溶性浸出物、显微、形状等进行鉴别，通过基因测序进行序列侧列，并进行系统发育分析，构建最大简约树和邻接树。商品沉香、人工沉香醇溶性浸出物提高10%，另可通过《中华人民共和国药典》中显微鉴别的规定进行[9]。沉香种内遗传存在距离，中间也存在距离。人工沉香、白木香、商品沉香均为发育树上的一支，在鉴别理化性质和浸出物基础上，再通过ITS2条形码序列可准确鉴定基原物，为沉香鉴定分子生物学的研究提供依据。

2.2 遗传多样性鉴定有研究通过ISSR分子标记技术鉴别48份不同生态环境的绞股蓝材料，探索其亲缘关系和遗传多样性，结果显示在15条扩增条带中，存在多态性明显引物和稳定性，共增加DNA扩增位点200余个。说明绞股蓝遗传多样性较高，种质间的亲缘关系、生态环境、地理分布完全不一样。

2.3 正品和替代品鉴定中药材正品为《中华人民共和国药典》收载的，替代品为与正品有亲缘关系且药效相似的但未收录到《中华人民共和国药典》中。分子鉴定技术可将正品和替代品进行鉴别和区分，研究采用ISSR、SRAP、SC0T分子标记等分子鉴定技术对冬虫夏草和替代品进行鉴定，对所有菌株进行有效区分且为总体状况相同，可作为冬虫夏草种内、株内鉴定的方法[10]。也有研究显示通过对独活样本的ITS序列测序和扩张，将样本分为4大类，ITS序列具有碱基片段，可通过ITS序列鉴定物种，能够为独活的分类和鉴定提供有利证据。另外，通过ITS序列鉴别四带芹类可作为独活的首选替代品，牛尾独活次之，九眼独活可作为药用上品。

2.4 真伪鉴定中药材的真伪鉴别多采用纤维鉴定方法，对鉴定人的专业水平有较高的要求，科学依据标准不统一，如采用化学计量法鉴别不但费时还浪费时间[11]。近些年来相关研究发现，通过分子鉴定技术鉴定中药材真伪的准确性较高，并且比较省时省力。常用于中药材乌梢蛇、重楼、西洋参、三七、人参、紫苏的真伪鉴别。有研究以新疆藁本、辽藁本及藁本混伪品白芷、当归、石防风为鉴定材料，通过提取样本的DNA进行序列扩增，进行双向测序可进行多序列比对，构建系统的发育树，能够鉴别新疆藁本和辽藁本的混伪品。混伪品材料及当归的序列测序，可对其基因序列进行分析比对，通过计算材料间的距离构建系统进化树。且测定trnL-F序列顺序，发现混伪品材料的碱基具有明显差异，并且可特异鉴别A碱基重复区域。混伪品间存在距离，通过trnL-Fxu序列对发育树进行重建并将混伪品和真品进行区分[12]。通过rpoC1序列比对无法找到混伪品和当归的差异位点。另外，进化树也无法找到差异，说明通过rpoC1序列鉴别效果不佳，而可通过trnL-Fxu序列以坚定混伪品的分子鉴定方法。研究当归的混伪品通过基因组多态性分析，从重复系列引物进行筛选出多态性好、稳定性高的引物并对其进行扩增，已获得更多基因组引物。可将UBC848引物组正品和混伪品分开鉴别，根据重复序列技术分析找到混伪品和当归的特异鉴别引物。通过SNP分子标记重新建立的PCR体系能够实现人参品种大马牙的鉴别分析，具有特异性条带，确实因大马牙特异性扩增得到扩张。建立多重PCR系统可实现大马牙的鉴定，作为大马牙品种鉴定的有效技术手段。

2.5 产地鉴别中药产地繁多，其中以道地药材为质量最佳，对于中药材的产地鉴别特别重要。近些年随着中药现代鉴别技术对中药产地进行鉴别研究。研究显示通过ISSE技术对丹参不同产地的样本进行鉴别[13]，也有通过DNA分析标记技术联合高效液相色谱对金银花不同产地样本进行鉴别，利用分子ISSR-PCR分子标记对菘蓝不同产地进行鉴别。有研究显示利用ISSR分子标记技术对甘肃省不同产地的当归样本进行分析，通过软件分析基因多样性指数和遗传信息，群间基因分数距离变化范围较大[14]。说明栽培当归在甘肃地区遗传多样性较高，群间的遗传多样性明显高于群内，居群间遗传分化程度较高，但无基本基因交流情况。

2.6 年限鉴别研究显示通过提取人参细胞中的端粒长度和端粒酶活性能够通过DNA鉴别人参生长年限，通过染色体片段分析人参端粒平均长度，端粒长度可随着年限的延长而延长，在此基础上可通过端粒长度数据鉴别人参的生长年限。对不同生长年限、不同产地、不同品种的人参样品经过提取RNA采用PCR扩增，扩增产物的序列，从多份人参样本中获得符合测序要求的PCR产物，并与人参DS基因比对，建立PCR测序发掘人参基因的SNP序列，具有操作简单、特异性[15]。分子标记技术可作为人参和相关药材产品质量评价遗传的工具。另有研究对水杉不同部位和不同年限的DNA进行提取，并进行序列扩增实验，结果显示经改良后的水杉DNA片段提取法，能够保存DNA片段扩增，在选择DNA提取样本中，边材比心材更适合，水杉木材DNA具有筛选分析、遗传距离、序列特征分析，以进行系列物种鉴别。

3 存在问题

中药分子鉴定技术被广泛应用在各个领域，但随着分子鉴定技术的发展也遇到了需要解决的问题。通过分子遗传标记技术对道地药材鉴定存在局限性，表现在自身技术缺陷，基因的真实性和DNA的同源性，分子标记结果的稳定性和重现性；另外研究对象也存在一定问题，不是所有的道地药材会有DNA印迹，道地性和DNA差异不存在直接关联。随着分子生物学研究的不断深入，技术缺陷问题已经得到解决，第2个问题仍然困扰着中药分子鉴定领域的专家学者。

4 小结

中药材的品种繁多，来源较复杂，且产地较多，相近的中药极易造成混淆，甚至出现中药用药部位不同但疗效相似的伪品和仿品充当真品。鉴定方法不完善会导致用药不安全事件发生，对中药临床疗效带来影响。《中华人民共和国药典》已经收录了部分中药材的分子生物学鉴定方法，说明分子鉴定的时代已经到来。虽然分子鉴定技术还需要进一步发展，但随着广大研究者的不懈努力和技术进步，分子鉴定技术一定能够成为中药鉴定的主要方法，为中医药走向国际提供技术保障。