孟 静， 吴裕健， 钟立霞， 程祥龙， 王 锐

(1.山东省食品药品检验研究院，山东济南250100；2.山东第一医科大学化学与制药工程学院，山东泰安271016)

1 引 言

生物素是水溶性B族维生素，又称VB7，是合成维生素C的必要物质，是一种维持人体自然生长、发育和正常人体机能健康所必需的营养素[1，2]。生物素测定的方法主要有液相色谱-质谱法[3～5]、高效液相色谱法[6～9]、酶联免疫法[10，11]和微生物法[12，13]。在特殊医学配方食品中生物素的测定过程中，由于基质影响，样品前处理和液相色谱冲洗阶段出现较大干扰，使得目标物测定检出限高，同时仪器方法测定的是结构相似的化合物，不能确定是否具有生物活性。而微生物方法测定的是有生物活性的生物素，最大程度反映了食品中能够被人体利用的生物素的含量，特殊医学用途配方食品是部分特定人群的唯一营养物质来源，因此对维生素添加量的监控尤为重要。GB 5009.259—2016《食品安全国家标准食品中生物素的测定》是我国现行特殊医学用途配方食品方法标准中生物素的指定测定方法，该方法为微生物法，它利用植物乳杆菌的生长浓度与生物素含量之间的对应关系，达到定量的目的。

微生物法中引入了微生物这一生长因素，它的活性及生长状态对实验结果的影响较大，为此对该方法进行不确定度评估，可为实验结果的质量控制提供数据参考。

本文采用微生物法测定特殊医学用途配方食品中生物素含量，并进行了不确定度评定。

2 材料和方法

2.1 材料及试剂

选取市售特殊医学配方乳粉作为待测样品，标签标识生物素含量为15 μg/100 g；生物素标准品购自美国药典(USP)；植物乳杆菌(ATCC 8014)、生物素测定培养基购自北京陆桥；浓硫酸、氢氧化钠均为分析纯。

2.2 仪器与设备

TOMY SX-500高压灭菌锅，Sigma 3-30K高速冷冻离心机，梅特勒MS204S分析天平，IKA MS3漩涡混合仪，Bioteck Epoch2C酶标仪，试管，移液管，移液器及容量瓶。

2.3 标准溶液配制

(1)生物素标准储备液(100 μg/mL)

精确称取100 mg生物素标准品,用乙醇溶液(50%)溶解并转移至1 000 mL容量瓶中,定容至刻度。

(2)生物素标准中间液(1.0 μg/mL)

吸取1.00 mL生物素标准储备液置于100 mL棕色容量瓶中,用乙醇溶液(50%)稀释并定容至刻度。

(3)生物素标准工作液(10 ng/mL)

吸取1.00 mL生物素标准中间液置于100 mL容量瓶中,用水稀释定容至刻度,混匀。

(4)标准使用工作液

分2个浓度,高浓度溶液的浓度为0.2 ng/mL;低浓度溶液的浓度为0.1 ng/mL。从工作液中吸取2次各5 mL,用水分别定容到250 mL和500 mL。

2.4 样品前处理及稀释

称取样品1 g(精确至0.000 1 g)至1个250 mL锥形瓶中，加入3%(体积比)硫酸溶液100 mL,121 ℃水解30 min,冷却后用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5±0.2,转到250 mL容量瓶中,用水定容,充分混合。用滤纸过滤,弃去最初的几毫升。吸取滤液5 mL,加入约20 mL水,用氢氧化钠溶液调pH值为6.8±0.2,转至100 mL容量瓶中,用水定容至刻度,作为待测液备用。

2.5 样品测定

取上述待测液与生物素测定培养基等体积混合后，121 ℃ 5 min灭菌，冷却后标准曲线管和各待测管中滴加1滴制备好的植物乳杆菌的菌液，36 ℃培养20 h，540 nm处测定其吸光度值，拟合标准曲线，计算样品测定液的生物素含量。

3 结果分析

3.1 测定原理及数学模型

GB 5009.210—2016[14]是利用植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)对生物素的特异性和灵敏性，定量测定出试样中待测物质的含量。在含有除待测物质以外所有营养成分的培养基中，微生物的生长与待测物质含量呈线性关系，根据透光率与标准工作曲线进行比较，即可计算出试样中待测物质的含量。

测量结果计算公式为：

3.2 测量不确定度的主要来源及评定

含量测定的不确定度主要是由方法的重复性误差,以及试验过程中所用试剂、仪器、器皿带来的系统误差[15，16]引起的。

3.2.1 测量重复性引入的不确定度

由于微生物生长的复杂性，菌株活性、培养温度的波动、生长环境pH值及溶液中氧的浓度等因素都会对菌株的生长有影响，进而产生实验结果的差异。这些因素引入的不确定度可通过重复性试验来评。在不同时间、同一名检验人员按照GB 5009.210-2016标准的要求对同一样品的生物素含量进行10次平行测定，结果见表1。

表1 乳粉中生物素的含量测定结果Tab.1 Determination of biotin in milk powder μg/100 g

10次测量结果的平均值为

测量结果的标准偏差为

则测量重复性引入的标准不确定度为

测量重复性引入的相对标准不确定度为：

3.2.2 生物素标准品引入的不确定度

生物素标准品引入的不确定度主要包括3个分量：生物素称量、生物素纯度、标准溶液配制。

(1)生物素称量引入的不确定度

用电子天平准确称取100 mg生物素标准品，所用天平最小分度为0.1 mg。根据检定证书，天平最大重复性误差为0.2 mg；当0≤m≤50 g时，示值误差为0.5 mg。按均匀分布，示值误差引入的不确定度u1和重复性误差引入的不确定度u2分别为：

合成标准不确定为：

相对标准不确定度为：

urel(m1)=u(m1)/m1=3.11×10-3

(2)生物素纯度引入的不确定度

根据生物素标准品说明书所述，其纯度p≥99.9%，按B类不确定度评定，区间的半宽度为0.001，视为均匀分布。

纯度引入标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

urel(p)=u(p)/p=5.77×10-4

(3)标准溶液配制过程引入的不确定度

标准溶液配制过程使用了容量瓶、移液管等玻璃仪器，主要不确定度来源包括移液管体积的不确定度、温度和重复性3个方面。

表2 各器具计算结果(标准溶液配制)Tab.2 Calculation result of each appliance (preparation of standard solution)

其中，1 000 mL容量瓶、500 mL容量瓶、250 mL容量瓶使用1次，100 mL容量瓶、5 mL移液管、1 mL移液管使用2次。合成玻璃器皿引入的不确定度：

urel(V1)=6.27×10-3

容量瓶和溶液的温度与校正时的温度不同，假设实验室温度变化介于±5 ℃之间，溶液的体积膨胀系数为±2.1×10-4，在95%的置信概率下按三角分布，k=1.96，温度变化带来的标准不确定度为

u(T1i)=2.1×10-4×5×V1i/1.96
=5.357×10-4V1i

相对标准不确定度为：

urel(T1i)=u(T1i)/V1i=5.357×10-4

合成各容器由温度带来的不确定度为：

由生物素标准品引入的合成相对标准不确定度为：

3.2.3 样品引入的不确定度

(1)样品称量引入的不确定度

称取的样品质量为1.004 1 g(准确至0.000 1 g)，因此其最大误差为±0.000 1 g，按照第3.2.2节中的方法计算样品称量引入的不确定度u(m)：

相对标准不确定度为

urel(m)=u(m)/m= 3.097×10-4

(2)样品稀释引入的不确定度

样品稀释过程中使用了容量瓶、移液管、1 mL吸头、200 μL吸头等器皿，按第3.2.2节中的方法评估的玻璃器皿引入的标准不确定度，结果见表3。

表3 各器具计算结果(样品稀释)Tab.3 Calculation result of each appliance(sample dilution)

合成样品稀释过程中玻璃器皿引入的相对不确定度：

urel(V2)=4.956×10-3

参照第3.2.2节中的方法计算温度变化带来的合成标准不确定度为：

urel(T2)=1.198×10-3

样品引入的相对标准不确定度为：

3.2.4 吸光度E测定过程引入的不确定度

根据检定证书，酶标仪的吸光度示值误差是0.5%，透射比重复性是0.0%，测定值一般为对称分布，则吸光度测定引入的相对标准不确定度为：

3.2.5 合成标准不确定度uc(X)的计算

3.2.6 扩展不确定度的评定

在95%的置信水平下，k=2，相对扩展不确定度为：

U=k×uc(X)=1.15 μg/100 g

最终得出该特殊医学配方乳粉的生物素含量为：(27.16±1.15)μg/100 g。

4 结 论

按照JJF 1059.1-2012的要求，采用微生物方法对特殊医学配方食品中生物素含量进行多次测定，得到的生物素含量范围为(27.16±1.15)μg/100 g。分析影响实验结果的各个分量包括重复性实验、标准溶液配制、样品称量稀释及吸光度的测定等，对不确定度影响最大的分量为实验的重复性。重复性试验中标准曲线、培养时间等均为可准确把控的因素，菌株活性没有可控制的指标，对实验的影响较大。在不同时间进行生物素测定，菌株的接种量、工作菌株代数都要保持相同的条件，最大程度上维持实验的稳定性，使不确定评定结果可用，提高实验数据的准确性。