薛林燕慧 杨九龙 于新娟 韩伟 李双保

1潍坊医学院临床医学院261053；2 青岛市市立医院呼吸与危重症医学二科266071

肺癌是严重威胁人类生命的一种肿瘤，其发病率与病死率极高。目前肺癌的诊断金标准仍是病理活组织检查，因其操作的有创性，并发症的危险性，需要探索一种更为方便、安全的检测方法。研究表明，血浆中微小RNA(micro RNA，mi RNA)的表达与肿瘤密切相关[1-3]，但易受体液中的核酸酶降解[4]，作为肿瘤标志物的价值受到质疑。外泌体中含有的mi RNA 具有更好的稳定性，可作为细胞间通讯的中介，越来越受到关注[5，6]。本文总结了外泌体mi RNA 作为肺癌生物标志物在肿瘤诊断、预后评估及药物疗效预测中的研究现状和进展。

1 外泌体mi RNA概述

外泌体曾在绵羊红细胞的培育中发现，被当作细胞产生的废物[7]。随着研究和技术的进展，人们逐渐认识到外泌体是一种具有细胞通讯功能的胞外小泡，近年来广受关注。外泌体是大小约为50～150 n m，外面是脂质双分子层，内里包含着各种生物活性物质，包括蛋白质、脂质和核酸 (DNA、mRNA、mi RNA、lnc RNA、circ RNA 等)。鉴于外泌体的保护作用，其携带的内容物可以较为稳定地游走于生物几乎所有体液环境中，在各种生理及病理过程中传递信息，发挥重要作用[8]。

mi RNA 是一种进化保守的，可以调控基因表达的非编码小RNA，约由20～22个核苷酸组成。如今，在人类基因组中，超过2 000个mi RNA 能够调控大约1/3基因的表达[9]。2002年，有研究提出了mi RNA 在肿瘤进展中的作用[10]，至今发现几乎所有已知的肿瘤都受到mi RNA 的调控，且在各种体液中检测到mi RNA 的表达。但由于体液中的mi RNA 易被RNA 酶降解，限制了其诊断标志物的作用。外泌体中的mi RNA 能够在包括血液、唾液、尿液、腹水、母乳、羊水、脑脊液、胸腔积液及支气管肺泡灌洗液等各种体液中稳定存在，有望成为理想肿瘤标志物[11-12]。

2 外泌体mi RNA在肺癌诊断中的应用

2.1 血浆外泌体mi RNA 对肺癌的诊断价值 2009 年Rabinowits等[13]研究发现非小细胞肺癌患者血浆外泌体总mi RNA 水平高于对照组，血浆外泌体中mi RNA 的类型特征与肺癌组织类似，提示外泌体mi RNA 可能成为肺癌的诊断标志物。2013 年，Cazzoli等[14]采用逆转录实时荧光定量聚合酶链反应 (reverse transcription-quantitative poly merase chain reaction，RT-q PCR)对10例肺腺癌患者和10例健康吸烟者的血浆进行全mi RNAs分析，并在大样本中验证了4 个mi RNA (mi R-378a、mi R-379、mi R-139-5p和mi R-200b-5p)在肺癌患者表达增高。采用这4 个mi RNA 的诊断模型对肺癌诊断的受试者工作特征曲线下面积 (area under curve，AUC)为0.908，敏感度为97.5%，特异度为72%，具有较好的诊断效果。Rodriguez等[15]采用类似方法，对30例非小细胞肺癌患者和75例非肿瘤患者的血浆及支气管肺泡灌洗液进行PCR 芯片分析，并在30例非小细胞肺癌和61例非肿瘤患者中进行了RT-qPCR 验证，发现非小细胞肺癌患者血浆外泌体mi R-141表达降低。另有研究发现肺癌患者血浆外泌体中mi R-193a-3p、let-7f-5p水平降低[16-17]。随着外泌体研究的进展，越来越多的外泌体mi RNA 被证明能够作为肺癌诊断标志物 (表1)。

2.2 血清外泌体mi RNA 对肺癌的诊断价值 近年来，人们开始探讨血清外泌体 mi RNA 与肺癌的相关性。Gri molizzi等[18]研究发现肺癌患者血清外泌体mi R-126 的表达高于健康对照者，mi R-126诊断模型的AUC 为0.859，且在疾病早期阶段，诊断模型的AUC 也高达0.875。Wu等[19]用RT-q PCR 方法检测56例肺癌患者和19例健康对照者，发现血清外泌体mi R-96表达上调，证实了其对肺癌诊断具有潜在价值。Feng等[20]发现肺腺癌患者血清外泌体中mi R-21-5p、mi R-140-5p和mi R-126-3p的表达水平高于健康对照组，四者联合诊断肺腺癌的AUC 高达0.97。随着血清外泌体mi RNA 的研究持续进展，多种血清mi RNA， 包 括 mi R-660-5p、 mi R-15b-5p、 mi R-25-3p、mi R-16-2-3p和mi R-221-3[21]，以及mi R-23b-3p[22]、mi R-7797 和mi R-98-3p[23]、mi R106b[24]、mi R-17-5p[25]、mi R-1290[26]等相继被证实在肺癌的诊断中有一定的临床价值，有成为非侵袭性诊断标志物的潜能。

2.3 胸腔积液外泌体mi RNA 对肺癌的诊断价值 不止于血液，胸腔积液也发现了与肺癌相关的外泌体mi RNA。Hydbring等[27]通过RT-q PCR 芯片检测18 例肺腺癌者和18例良性炎性病变患者的胸腔积液外泌体，发现mi R-200家 族 mi RNA (mi R-200a、mi R-200b、mi R-200c、mi R-141)表达上调，其诊断模型的AUC 介于0.898 7～0.973 9。另一项研究通过高通量测序和RT-q PCR 验证了9个 mi RNA (mi R-203a-3p、mi R-205-5p、mi R-375、mi R-200b-3p、mi R-200c-3p、mi R-141-3p、mi R-200a-3p、mi R-483-5p和mi R-429)在肺腺癌患者胸腔积液外泌体中表达升高[28]。Ta miya等[29]发现外泌体mi R-182和mi R-210在肺癌恶性胸腔积液中表达上调，胸腔积液外泌体mi RNAs可作为肺癌诊断的标志物。

2.4 支气管肺泡灌洗液外泌体mi RNA 对肺癌的诊断价值 支气管肺泡灌洗检查能获得肺泡表面衬液，直接取得局部病变的信息。所以国外专家开始对肺泡灌洗液中外泌体mi RNA 进行研究。Ki m 等[30]研究发现，对比炎性病变，肺腺癌患者支气管肺泡灌洗液外泌体中和组织中mi R-126都高表达。Ro man-Canal等[31]也发现在肺癌患者支气管肺泡灌洗液外泌体中 mi RNA-1-3p、mi RNA-144-5p 和mi RNA 150-5p表达上调，三者联合的诊断模型AUC 达到0.914，具有成为诊断肺癌生物标记物的前景。

3 外泌体mi RNA在评估肺癌预后中的应用

许多学者研究了外泌体mi RNAs与肺癌预后及复发的关系。Liu等[32]发现血浆外泌体mi R-23b-3p、mi R-10b-5p和mi R-21-5p表达升高的肺腺癌患者总生存期降低，将这3种外泌体mi RNA 与临床变量相结合，能提高生存预测的准确性。Deji ma等[33]发现血浆外泌体mi R-21和mi R-4257在复发的肺癌患者中表达水平上调，而无病生存期降低。另外，Kanaoka等[34]研究发现，血浆外泌体mi R-451a在复发的非小细胞肺癌患者中表达上调，与淋巴结转移、血管浸润和分期显著相关，外泌体mi R-451a高表达患者的总生存期和无病生存期明显降低。Xue等[35]研究发现血浆外泌体 mi R-106b-3p、mi R-10b-5p、mi R-151a-5p、mi R-484和mi R-192-5p在肺腺癌中表达上调，且这些mi RNA 表达升高的患者生存几率降低。近年来的研究证实，外泌体mi R-1290高表达、mi R-216b低表达、mi R-1246 高表达皆与肺癌的预后不良密切相关[26，36-37]。以上表明外泌体mi RNA 可作为评估肺癌预后的生物标志物，见表2。

4 外泌体mi RNA在预测药物疗效中的作用

外泌体mi RNA 对治疗后效果起到预测作用。有研究发现，外泌体中mi R-512和mi R-373的高表达会增强顺铂诱导的细胞凋亡和抑制细胞迁移[38]。Yuwen 等[39]发现mi R-146a-5p通过抑制自噬作用提高非小细胞肺癌对顺铂的敏感性，提示血清外泌体mi R-146a-5p可作为预测顺铂治疗非小细胞肺癌疗效和实时监测耐药性的新的生物标志物。另一项研究表明，血清外泌体mi R-425-3p 通过靶向AKT1上调自噬水平，使得铂类治疗效果减低，mi R-425-3p高表达患者治疗效果不佳[40]。这些研究说明了外泌体mi RNA 可成为预测药物疗效的生物标志物。

5 外泌体mi RNA作为诊断生物标记物的不足

病理活组织检查仍是目前肿瘤诊断的金标准，外泌体的研究尚未成熟，且存在一定局限性，主要存在以下几个方面：首先，外泌体的提取没有建立统一的规范化操作，不同的外泌体提取方法各有优缺点，提取的纯度也不尽相同，各个实验室的结果良莠不齐，因此目前尚不适合在临床上大规模应用；其次，外泌体来源的异质性也需要受到关注，人体正常细胞及肿瘤细胞皆可产生外泌体；而且，手术、放化疗等治疗，甚至生活习惯都可能影响细胞对外泌体的释放，造成假阴性或假阳性的结果。

6 总结与展望

肺癌的发病率和病死率高居不下，需要开发一种无创、有效的诊断和预后筛查工具。外泌体的mi RNA 易于从患者体内采集，在循环中相对稳定，可以成为肿瘤诊断和预后的理想生物标志物。未来，外泌体的研究方向将侧重于统一外泌体提取、纯化、存储方法，寻找更为经济、更加省时、更有效的方法，为外泌体mi RNA 成为肿瘤诊断和预后标志物的研究奠定坚实的基础。

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