王艳艳， 王俊瑞， 郑文琪， 申慧敏， 吕莹莹， 郭素芳

（内蒙古医科大学附属医院检验科，内蒙古 呼和浩特 010050）

艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种专性厌氧、革兰染色阳性的粗大芽孢杆菌，是医院内抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎的主要病原体[1]。为了解呼和浩特地区临床腹泻患者艰难梭菌感染情况，本研究对临床疑似抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎患者粪便样本进行艰难梭菌分离和培养，并检测艰难梭菌毒素基因，对产毒艰难梭菌进行多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST），为艰难梭菌感染的诊治提供参考。

1 材料和方法

1.1 样本来源

收集2018年7月—2019年12月内蒙古医科大学附属医院疑似抗菌药物相关腹泻和伪膜性肠炎成人患者的粪便样本326份。

1.2 试剂与仪器

艰难梭菌显色培养基、厌氧产气袋、VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪及配套ACT/ANC卡和VITEK MS微生物质谱鉴定系统（法国生物梅里埃公司），Efficiency 96基因扩增仪（北京领宇科技有限公司），聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）酶[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.3 方法

1.3.1 菌株培养及鉴定 将适量粪便样本与无水乙醇按1∶1体积混合，静置1 h后接种于艰难梭菌显色培养基。35 ℃厌氧培养48 h。选择显色平板上黑色、边缘不整，有特殊马粪味的革兰染色阳性大杆菌进行分离纯化。采用VITEK 2 Compact自动化鉴定药敏仪和VITEK MS微生物质谱鉴定系统进行菌种鉴定。

1.3.2 毒素基因检测 采用热激法提取细菌DNA，扩增艰难梭菌毒素基因（tcdA、tcdB）和二元毒素基因（cdtA、cdtB），明确是否为产毒艰难梭菌菌株。

1.3.3 MLST 参考文献[1]扩增艰难梭菌7个管家基因（adk、atpA、dxr、glyA、recA、sodA和tpi）。引物由中美泰和生物技术（北京）有限公司合成，引物序列见表1。……