李佳 杨晓丽 杨小丹 田洋 白忠彬

(1云南农业大学食品科学技术学院 云南昆明 650201;2云南省生物大数据重点实验室 云南昆明 650201)

铁皮石斛（Dendrobium officinale）是兰科属草本植物，又称铁皮兰、黑节草。因其喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境［1］，秦岭、淮河以南的皖、浙以及云、贵、川等地成为了中国铁皮石斛的主要分布地［2］。由于野生铁皮石斛生长条件的特殊性和分布的局限性，又经长期采挖，自然资源濒临枯竭，国内市场供应紧缺。铁皮石斛又被称为“九大仙草之首”，味甘、性微寒，在《本草纲目》中记载“石斛气平，味甘、淡、微咸，阴中之阳，降也”［3］，即铁皮石斛有补肾脏、调理脾胃、滋阴补阳、补养脏腑、清热除痹、延年益寿之功效［4-5］。

铁皮石斛中含有多种功能活性物质，主要有多糖、氨基酸类、生物碱和多种微量元素［6-8］。多糖是糖类在自然界中的主要存在形式，有些多糖具有某种特殊的生理活性称为活性多糖。多糖是铁皮石斛主要功效成分，且含量较高；根据现代药理学研究，铁皮石斛多糖具有抗氧化、免疫调节、抗肿瘤、降血糖及其他作用（抑菌、促进毛发生长、抗衰老、降血压等）［9-10］，因此在功能性食品、药品和化妆品行业中具有良好的发展前景［11-13］。云南林下仿生铁皮石斛功能活性成分含量较市场上所售石斛高，营养更为丰富，因此，研究其活性成分高效、便捷的提取工艺，对于中国铁皮石斛的市场开发有重要意义。本研究通过单因素试验结合响应面设计对铁皮石斛多糖的提取工艺进行优化，使用热水浸提法来提取铁皮石斛多糖，结合苯酚-硫酸法［11］测定铁皮石斛多糖含量，再用Box-Behnken组合设计试验方案来优化分离纯化条件［12-14］，旨在为铁皮石斛多糖的功能活性研究奠定基础，进而为铁皮石斛今后的市场发展提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 铁皮石斛

云南省普洱市斛哥庄园，为仿野生林下铁皮石斛。

1.1.2 试剂

硫酸（重庆川东化工有限公司），苯酚（Aladdin），无水乙醇（天津市风船化学试剂科技有限公司），正己烷（重庆川东化工有限公司），正丁醇（重庆川东化工有限公司），三氯甲烷（重庆川东化工有限公司），无水葡萄糖（广东光华科技股份有限公司），所有有机试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

FA1004N分析天平（上海精密科学仪器有限公司），HH-S数显恒温水浴锅（常州市华普达数学仪器有限公司），IUV-5100紫外-可见分光光度计（上海元析仪器有限公司），RE-3000A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SC-36低速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），FD-1A-50真空冷冻干燥机（上海比郎仪器制造有限公司），FL-2Y电炉（上海力辰邦西仪器科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 铁皮石斛多糖的提取

1.2.1.1 原料的选择和处理

取林下仿生铁皮石斛鲜条切段，每段长度0.5～1.0 cm，称取铁皮石解鲜条段300.000g，于60℃恒温干燥2～3 d；将烘干后的铁皮石斛磨碎成粉，过100目筛，保存备用。

1.2.1.2 铁皮石斛脱脂

用分析天平准确称取铁皮石斛粉末25.000g，加入5倍体积的正己烷，用磁力搅拌器搅拌48h后用滤纸过滤；往滤渣中再加入5倍体积的95%乙醇搅拌48 h后过滤；将滤渣放入陶瓷盘子中自然风干。

1.2.1.3 多糖提取

用分析天平准确称取铁皮石斛粉未5.000 g，加入装有400mL蒸馏水的500mL烧杯中，打开电炉垫石棉网加热至95～100℃提取，溶液沸腾时开始计时（2 h）；冷却至室温后用6层纱布过滤，加400mL蒸馏水对滤渣重复浸提2次，依次进行过滤操作。

1.2.1.4 提取液处理

合并上述3次经过滤的多糖提取液，在旋转蒸发仪（56～60℃）上旋转蒸发浓缩至200 mL左右。Sevage法除蛋白：在多糖溶液中加入1/4的Sevage试剂（正丁醇∶三氯甲烷＝1∶4，V∶V），于摇床上30min，离心去除水层与溶剂层之间的变性蛋白层，重复操作6～8次，直至无变性蛋白析出。

1.2.1.5 冷冻干燥

量取经脱蛋白处理的多糖溶液，加入4倍体积95%乙醇，于4℃冰箱静置12 h后进行离心，以转速3500 r/min处理10 min；弃去上清液收集沉淀，将沉淀放入冻干盘中置于-80℃冰箱预冷冻；将已冻结的多糖真空冷冻干燥3～4 d，研磨成粉，装入离心管或自封袋，即得铁皮石解多糖粉末样品。

1.2.2 铁皮石斛多糖含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的绘制

精确称取0.500 g干燥至恒重的无水葡萄糖，配制成浓度为0.100 mg/mL的标准溶液；取11支试管，分别加入 0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mL标准溶液，补齐蒸馏水体积至2.0 mL；加入5%苯酚溶液1.000 mL，摇匀，再加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，沸水浴煮沸15 min，以流动水冷却至室温后在490nm处测量吸光度；以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线（图1）。

图1 苯酚-硫酸法检测标准曲线

1.2.2.2 苯酚-硫酸法测定铁皮石斛多糖含量

准确量取待检测多糖溶液1.0mL于10.0mL具塞试管中，加水至2.0 mL，按标准曲线的制备方法，加入1.0 mL 5%苯酚溶液，震荡摇匀，加入5.0 mL浓硫酸，摇匀，沸水浴15 min后，以流动水冲洗至室温，在紫外分光光度计490nm波长处测定吸光度；从标准曲线上读出样品溶液中铁皮石斛多糖浓度，通过多糖含量的计算方法计算铁皮石斛多糖含量、纯度及提取率。

式中：C表示标准曲线上读出的多糖浓度（mg/mL）；C母表示样品浓度，0.1 mg/mL；F表示样品稀释倍数（100倍）；0.91表示葡萄糖的校正系数。

1.2.3 单因素试验设计

1.2.3.1 液料比对铁皮石斛多糖含量的影响

称取5.000 g的铁皮石斛粉末，以液料比为自变量做单因素试验。固定多糖提取条件为提取温度95℃、提取时间1.5h、提取次数3次，考察液料比20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 （mL/g）对铁皮石斛多糖含量的影响。

1.2.3.2 提取次数对铁皮石斛多糖含量的影响

称取5.000 g的铁皮石斛粉末，以提取次数为自变量做单因素试验。固定多糖提取条件为提取温度95℃、液料比80∶1（mL/g）、提取时间1.5h，考察提取次数1、2、3、4、5次对铁皮石斛多糖含量的影响。

1.2.3.3 提取时间对铁皮石斛多糖含量的影响

称取5.000 g的铁皮石斛粉末，以提取时间为自变量做单因素试验。固定其他提取条件为液料比80∶1（mL/g）、提取次数3次、提取温度95℃，考察提取时间1.0、1.5、2、2.5、3.0 h对铁皮石斛多糖含量的影响。

1.2.3.4 提取温度对铁皮石斛多糖含量的影响

称取5.000 g的铁皮石斛粉末，以提取温度为自变量做单因素试验。固定多糖提取条件为液料比80∶1（mL/g）、提取时间1.5 h、提取次数3次，考察提取温度60、70、80、90、95℃对多糖含量的影响。

1.2.4 Box-Behnken设计试验方案

在单因素的基础上，应用Design Expert 8.0.6软件进行试验设计，研究各参数对考察指标的影响规律，并得到最优提取条件。以提取温度、提取时间、液料比和提取次数为自变量，以铁皮石斛多糖含量为响应值，其因素水平编码见表1。

表1 响应面试验因子水平及编码

1.2.5 铁皮石斛多糖理化指标检测

采用GB/T 5009.3—2016标准规定的方法检测多糖中的水分［15］，多糖中灰分按GB/T 5009.4—2016规定方法检测［16］。

1.2.6 铁皮石斛多糖中无机元素含量测定

按GB/T 5009.91—2017规定的方法检测多糖中钾元素［17］；按GB/T 5009.13—2017规定的方法检测多糖中铜元素［18］；按GB/T 5009.241—2017规定的方法检测多糖中镁元素［19］；按GB/T 5009.14—2017规定的方法检测多糖中锌元素［20］；按GB/T 5009.92—2016规定的方法检测多糖中钙元素［21］；按GB/T 5009.93—2017规定的方法检测多糖中硒元素［22］；按GB/T 5009.242—2017规定的方法检测多糖中锰元素［23］。

1.2.7 铁皮石斛多糖中氨基酸成分检测

多糖中氨基酸含量按GB/T 5009.124—2016规定的方法检测［24］。

1.2.8 数据处理

试验数据为3次重复平均值，采用Excel进行数据统计和作图，SPSS 5.0软件进行数据分析；利用Design-Expert 8.0研究液料比、提取温度、提取时间及提取次数对铁皮石斛多糖含量的影响。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 液料比对铁皮石斛多糖含量的影响

图2显示，液料比在20∶1和40∶1时，铁皮石斛多糖含量较低。原因是由于20∶1和40∶1时，液料比过低而多糖提取溶液浓度过高，多糖还粘附在铁皮石斛表面，过滤时将多糖随铁皮石斛残渣滤掉，导致多糖含量降低。液料比增加到60∶1时，铁皮石斛多糖含量显著上升，是因为随料液的增加多糖提取比较充分，但由于经过粗纯化的多糖其溶解性好，因此随着液料比的增加，多糖在后续的过滤过程中有所损失，导致含量下降。因此，液料比60∶1为铁皮石斛多糖提取的最适液料比。

图2 液料比对铁皮石斛多糖含量的影响

2.1.2 提取次数对铁皮石斛多糖含量的影响

图3显示，提取次数1～2次铁皮石斛含量显著下降。提取1～2次不足以将多糖提取完全，造成多糖大量损失；当提取到3次时，多糖含量提取比较完全；提取次数超过3次以后铁皮石斛多糖含量逐渐下降，可能是提取次数过多，多糖因粘带滤渣被过滤掉而导致含量下降。在提取次数为3次时铁皮石斛多糖含量最高，因此3次为铁皮石斛多糖提取的最适提取次数。

图3 提取次数对铁皮石斛多糖含量的影响

2.1.3 提取时间对铁皮石斛多糖含量的影响

图4显示，提取时间对铁皮石斛多糖含量的影响比较大。提取时间为3.0h时铁皮石斛多糖含量最低，2.5 h时最高，铁皮石斛多糖需要一定时间才能够完全溶出。因此，提取时间2.5h为铁皮石斛多糖的最适提取时间。

图4 提取时间对铁皮石斛多糖含量的影响

2.1.4 提取温度对铁皮石斛多糖含量的影响

图5显示，随着提取温度的不断增加，铁皮石斛多糖含量也在明显增大，提取温度在90℃时铁皮石斛多糖含量最高，之后多糖含量又有所下降，是由于多糖在高温下发生部分水解［25］。

图5 提取温度对铁皮石斛多糖含量的影响

2.2 响应面试验

基于单因素试验分析，根据Box-Benhnken中心组合设计四因子三水平的响应面分析试验，试验方案根据表1的因子与水平设计，所得响应面的试验设计及结果见表2。

表2 响应面试验设计及结果

续表2 响应面试验设计及结果

从响应面的设计及试验结果，获得以铁皮石斛多糖含量为响应值的二次回归方程为：

Y＝91.19＋4.72A-3.63B＋5C－4.28D-0.45AB＋1.22AC＋4.93AD＋4.36BC－8.65BD－0.12CD－15.51A2＋4.42B2－10.56C2－11.11D2

回归模型方差分析见表3。利用方差分析结果建立的回归模型p＜0.000 1，达到极显著水平，得出R2＝0.928 5，Radj2＝0.845 1，说明模型能够较好地反映响应值的变化；失拟项（p＝1）不显著，说明回归模型和预测值之间有较好拟合度。

表3 回归模型方差分析

通过液料比、提取次数、提取时间、提取温度的试验设计优化，得到相应的数据分析。二次方程回归系数的显著性表明，因素C（提取温度）（p＜0.010）、A（液料比）（p＜0.010）对铁皮石斛多糖含量提取效应极显著；因素B（提取时间）（p＜0.050）、因素D（提取时间）（p＜0.050）对铁皮石斛多糖含量提取影响显著；交互项BD对铁皮石斛多糖含量提取影响显著，其余交互项影响均不显著；二次项A2、C2、D2（p＜0.010）对铁皮石斛多糖含量提取影响极显著。各因素对多糖含量的影响顺序：提取次数二次项＞提取温度二次项＞提取时间和提取次数交互项＝提取温度一次项＞液料比一次项＞提取次数一次项＞提取时间一次项＞提取时间二次项＞液料比和提取次数交互项＞提取时间和提取温度交互项＞液料比和提取温度交互项＞液料比和提取时间交互项＞提取温度和提取次数交互项。

根据回归模型作出相应的响应面和等高线（图6～11），从各个因素交互作用对响应面进行分析，响应面等高线图可直观地反映各因素对响应值的影响，以便找出最佳工艺参数以及各参数之间的相互作用，等高线中最小椭圆的中心点即为响应面的最高点。

图6 提取时间与液料比对铁皮石斛多糖含量影响的响应面图和等高线图

图7 提取温度与液料比对铁皮石斛多糖含量影响的响应面图和等高线

图8 提取次数与液料比对铁皮石斛多糖含量影响的响应面图和等高线

图9 提取温度与提取时间对铁皮石斛多糖含量影响的响应面和等高线

图10 提取次数与提取时间对铁皮石斛多糖含量影响的响应面图和等高线

图11 提取次数与提取温度对铁皮石斛多糖含量影响的响应面图和等高线

等高线的形状可反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。响应面图中曲线越弯曲，说明研究因素对结果影响越大，等高线呈椭圆形说明研究因素之间的交互作用显著，呈圆形则说明交互作用不显著。通过三维图，观察曲面的倾斜度，确定二者对响应值的影响程度，倾斜度越高即坡度越陡，说明二者交互作用越显著。从响应面和等高线图可以看出，提取温度与液料比的交互作用对铁皮石斛多糖含量提取的影响最显著。

2.3 验证试验

通过响应面方法的设计，得到铁皮石斛多糖提取的最佳条件为：液料比61.48∶1，提取时间2.02h，提取温度88.96℃，提取次数3.13次，预测的多糖含量为99.09%。但由于实际操作条件的限制，将提取的最优提取工艺设置为：提取温度90℃，提取时间2.5h，液料比60∶1，提取次数3次。在此条件下提取率为32%，多糖含量的理论预测值为98.63%。在此条件下进行试验验证，得到的多糖提取率接近35%，同时3次试验测得的多糖含量平均值为85.33%。因此，响应面法对铁皮石斛多糖提取条件的优化是稳定可行的。

2.4 铁皮石斛多糖的成分分析

通过检测铁皮石斛多糖粉末中影响其理化性质的成分可知，其水分含量为7.39%，灰分含量达到3.56%，由于进行了冻干，因此水分含量较少，溶解后的多糖溶液较为粘稠。

无机元素检测结果显示，铁皮石斛多糖中无机元素的总量为1.39%，其中K含量0.231%，Cu含量0.042%，Mg含量0.087%，Zn含量0.007%，Ca含量1.01%，Mn含量0.013%，Se含量0.003%。铁皮石斛多糖中富含无机盐，可以维持机体正常的生命活动，比如Ca含量较高，可以有效地防治骨质疏松；Zn可以提高机体的免疫力等。

经检测可知，铁皮石斛多糖中含有16种氨基酸，其中包括7种成人必需氨基酸，9种非必需氨基酸，见表4。

表4 铁皮石斛多糖中氨基酸含量

3 讨论与结论

铁皮石斛多糖的提取方法主要有传统热水浸提法、超声波辅助提取法、微波辅助提取法、酶辅助提取法、超临界辅助提取法等［26］。不同工艺对多糖成品的质量、结构、活性以及提取率均有很大的影响。本研究主要探讨了铁皮石斛的液料比、提取次数、提取温度和提取时间对多糖含量提取的影响，在40∶1～100∶1对液料比进行优化，当液料比为40∶1时，由于溶剂较少，铁皮石斛多糖无法完全提取，所以多糖含量较低，结合实际操作过程认为，液料比在60∶1时提取多糖最优。在提取次数不断增加时，铁皮石斛中的多糖含量逐渐减小，并在提取次数为3次时多糖含量最高。通过对铁皮石斛提取时间进行研究发现，随提取时间延长，多糖含量有所减少，提取时间在2.5 h时效果良好。提取温度在60～90℃时，多糖含量随提取温度的提高逐渐增加，在100℃时又明显下降，因此最适提取温度为90℃。通过响应面优化铁皮石斛多糖的分离粗纯化条件，铁皮石斛多糖提取的最优条件为提取温度90℃，提取时间2.5h，液料比60∶1，提取次数3次；在此条件下提取率接近35%，多糖含量为85.33%。与李程程等［27］提取效果基本吻合。

本研究对铁皮石斛粉末进行脱脂处理，并对铁皮石斛提取液进行透析以除去小分子物质及盐类，经醇沉冷冻干燥后，根据多糖含量计算方法，得到铁皮石斛多糖纯度为85.33%。通过对铁皮石斛多糖组分中的灰分、水分以及无机元素、氨基酸进行分析可知，其水分含量为7.39%，灰分含量达到3.56%，无机元素的总量为1.39%，氨基酸总量为0.67%，含16种氨基酸，包括7种成年人必需氨基酸和9种非必需氨基酸。由此可见，在本试验条件下提取到的铁皮石斛多糖富含人体必需氨基酸，且矿物质含量丰富，商业价值更高。