刘立民，刘雪香，邹 燕，黄志卓

（柳州市工人医院/广西医科大学第四附属医院医学检验科，广西柳州 545005）

1 lncRNA 概述

长链非编码RNA（long non-coding RNA，lnc RNA）是一类长度超过200 nt 且无编码蛋白能力的RNA 序列。lncRNA 转录过程与信使RNA 类似，主要由RNA 聚合酶II 参与，部分lncRNA 进行转录后修饰，形成3’poly 加尾和5’cap 带帽结构。lncRNA 的表达通常具有细胞特异性和时空特异性，其可分布在细胞核或细胞质或者两者中均有。lncRNA 在转录、转录调节、翻译以及翻译后的修饰等水平，通过多种机制如基因组因子、染色体重塑、作为海绵体吸附微小RNA，作为中间体连接RNA 与蛋白和DNA 形成调控复合物等，调控细胞的凋亡、增殖、发育、成熟和分化[1]。lncRNA 在免疫细胞和免疫性疾病的作用和机制的研究处于起步阶段，是医学领域的研究热点。

2 lncRNA 与CD4+T 淋巴细胞

CD4+T 淋巴细胞在适应性免疫反应起到关键调节作用，主要包括Th1, Th2, Th17, Tfh, Th9, Th10, Th22, Treg 和Tfr 等[2]。CD4+T 细胞相互配合共同维持适应免疫应答的平衡。机体免疫功能异常致CD4+T 细胞亚群比例失调，可能引起免疫失衡甚至引起免疫性疾病[3]。lncRNA 在调控CD4+T 细胞的增殖分化和功能研究以及在相关免疫性疾病的作用已有报道，本综述简要汇总lncRNA 在调控CD4+T细胞增殖分化和在免疫性疾病中的研究进展。

2.1 lncRNA 与Th1 细胞 Th1 细胞主要参与抗病毒、细胞内细菌的细胞免疫和迟发型超敏反应等[4]。通过人的T 细胞亚群RNA-seq 数据分析，linc-MAF-4 被鉴定出来，定位在MAF 基因（Avian musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog，MAF）上游139.5kb。linc-MAF-4 是Th1 细胞特异性表达的lncRNA，主要功能是抑制MAF 的表达。linc-MAF-4 直接与果蝇zeste 基因增强子的人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和赖氨酸特异性组蛋白脱甲基酶1A（lysine-specific histone demethylase 1A，LSD1）相互作用形成复合物沉积在MAF 的启动子区域，增强MAF 的H3K27 me3 水平沉默MAF 表达。人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMC）敲除linc-MAF-4 后，引起CD4+T 细胞向Th2 细胞分化偏移。人的naive CD4+T 细胞过表达linc-MAF-4 后，可促进Th1 细胞分化并抑制Th2 细胞分化，上述研究表明linc-MAF-4 促进Th1 细胞分化的重要分子之一[5]。NeST（Nettoie Salmonella pasTheiler’s，NeST）也是Th1 细胞特异表达的lncRNA，位于干扰素-γ 基因（interferon-γ，IFN-γ）的反义链上。在人和鼠的CD4+T 细胞体外诱导分化中发现IFN-γ 和NeST 在Th1 细胞表达最高。体外诱导D011.10.Stat4 −/− 和DO11.10.Tbx21 −/−小鼠的Th1 细胞，IFN-γ 和NeST 在Th1 细胞的表达均显著降低。在NeST 敲低后的细胞，IFN-γ 的表达降低。ChIP-qPCR 实验证明NeST 与WDR5 相互作用。在过表达NeST 的小鼠模型，明显促进IFN-γ的表达，并且IFN-γ 转录调控区的H3K4 me3 的水平增加[6]。因此，Th1 细胞的NeST 对IFN-γ 的表达发挥了重要作用。NKILA（NF-κB-interacting long noncoding RNA，NKILA)是一种与NF-κB 相互作用的长链非编码RNA，通过抑制NF-κB 活性调节T 细胞对活化诱导细胞凋亡的敏感性。T 细胞受体信号激活引起钙离子流向T 细胞的激活钙调蛋白，引起NKILA 启动子区去乙酰化酶减少进而增强STAT1 介导的转录。

2.2 lncRNA 与Th2 细胞 Th2 细胞协助B 细胞诱发体液免疫应答、清除细胞外微生物和肠道蠕虫等寄生虫。Th2 细胞参与抗体类别转换促进产生IgE，引起或维持过敏反应。在IL-4 刺激下，诱导STAT6 磷酸化，激活Th2 细胞特异性转录因子GATA3，引起Th2 细胞分化[7]。在Th2 细胞中特异性表达的lncRNA GATA3-AS1 位于GATA3 基因的反义链上，是反义lncRNA，主要分布在细胞核中。在PBMC 中通过小干扰RNA（Small interfering RNA，siRNA）敲除GATA3-AS1，体外Th2 诱导分化条件下，GATA3，IL-13 和IL-5 的mRNA 和蛋白水平都明显降低。ChIP-qPCR 实验显示，细胞敲除GATA3-AS1 后，GATA3 和GATA3-AS1 基因的H3K4 me2/3 和H3K27ac 的修饰水平降低。具体机制是GATA3-AS1 和GATA3-AS1 内含子DNA形成R 环，同时GATA3-AS1 与染色质修饰蛋白MLLH3k4 结合，抑制目的基因转录。虽然GATA3-AS1 不能诱导Th2 表型，但是GATA3-AS1 不仅调节GATA3 和Th2 效应细胞因子IL-5 和IL-13 的表达，而且可以修饰GATA3 和GATA3-AS1 的染色质分布[8]。lincRNA LincR-Ccr2-5’AS 在Th2 细胞中特异性高表达，调控Th2 细胞特异表达的基因和Th2 细胞的迁移。在Th2 细胞中通过使用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）敲 除LincR-Ccr2-5’AS 后，Th2 细胞表面分子CCR1，CCR3，CCR2，CCR5表达下降；C57BL/6 小鼠敲除LincR-Ccr2-5’AS 基因后，肺部迁移的Th2 细胞明显低于正常对照组。LincR-Ccr2-5’AS 调 控CCR 基因(C-C chemokine receptor，CCR)表达与修饰染色质的可接近性和招募RNA 聚合酶II 无关，但具体的调控机制还不清楚[9]。lncRNA NEAT1（nuclear enriched abundant transcript，NEAT1）促进Th2 细胞的分化，RIP 实验证明NEAT1 与EZH2 结合，被募集到ITCH 启动子区域，抑制ITCH 表达，降低STAT6 泛素化，促进了IL-4，IL-5 和IL-13 的表达[10]。TH2-LCR（locus control region，LCR）是一组lncRNA 簇，人类编码Th2-LCR lncRNA 基因与RAD50 基因重叠，小鼠的与TH2 基因座控制区（LCR）相邻。TH2-LCR 在Th2 细胞中特异性高表达，主要分布在细胞核中，包含四种可变剪切序列，调控Th2 细胞分泌IL-4，IL-5，IL-13 的表达[11]。

2.3 lncRNA 与Th17 细胞 Naive CD4+T 细胞在IL-1β，IL-6，IL-23 和TGF-β 等细胞因子刺激下，激活SOCS1，SMAD7 和STAT3 信号，引起RORγt 转录因子高表达，分泌IL-17，IL-17F 和IL-22细胞因子，分化为Th17 细胞[12]。lncRNADDIT4主要表达在Th17 细胞中，位于DDIT4 基因(DNA damage-inducible transcript 4，DDIT4) 的下游，提示lncRNADDIT4 具有潜在调控功能。DDIT4是胞浆蛋白，在DNA 损伤中表达上调且抑制mTORC1（mechanistic target of rapamycin complex 1，mTORC1）的激活[13-14]。人naive CD4+T 细胞中敲除lncRNADDIT4，在Th17 的诱导条件下，DDIT4 表达降低、DDIT/mTOR 信号增强且促进Th17 细胞分化。相反，人naive CD4+T 细胞中过表达lncRNADDIT4，在Th17 诱导条件下，DDIT4 表达增加、DDIT/mTOR 信号减弱且Th17 抑制细胞分化。NEAT1 调控Th17 细胞分化，当敲除NEAT1后，可促进下游分子STAT3 泛素化，抑制Th17 细胞分化[15]。IL-23/STAT3 信号通路在促进Th17 细胞分化中起到主要作用。lncRNA-1700040D17Rik是EAE 模型小鼠的lncRNA 微阵列筛选表达降低的lncRNA；内源性IL-23 拮抗剂rhIL23R-CHR 处理EAE 模型小鼠后，lncRNA-1700040D17Rik 表达显著增加。lncRNA-1700040D17Rik 通过调控Th17 细胞的RORγt 表达，影响Th17 细胞分化。lncRNA-1700040D17Rik 调控Th17 细胞分化，可能作为自身免疫性疾病的治疗靶标或生物标志物[16]。通过微阵列热图筛选哮喘患者的外周血CD4+T 细胞表达的差异lncRNA 和microRNA，发现lncRNAMEG3 明显升高，microRNA-17 明显下降。CD4+T细胞敲除lncRNA-MEG3 后，抑制Th17 细胞分化；过表达lncRNA-MEG3 后，促进Th17 细胞分化。MicroRNA-17 作用于靶基因RORγt，引起RORγt mRNA 稳定性下降。lncRNA-MEG3 通过抑制microRNA-17 的水平，促进RORγt 的mRNA和蛋白表达，提示lncRNA/microRNA 轴可能在疾病的临床治疗和诊断中具有潜在的应用价值[17]。

2.4 lncRNA 与Treg 细胞 NaiveCD4+T 细胞在IL-2 和TGF-β 等细胞因子刺激下分化为Treg 细胞。Treg 细胞高表达的Foxp3，激活SOCS1，SMAD3，STAT3，STAT5 和mTOR 信 号，促 进TGF-β 分泌，在维持免疫自稳定和自身耐受中发挥作用[18]。Flicr 是Treg 细胞中特异性低表达的lncRNA，位于Foxp3 转录起始位点上游1.8kb。通过CRISPR/Cas9技术敲除Flicr，Treg 细胞的Foxp3 转录增加，说明Flicr 抑制Treg 细胞Foxp3 表达。Flicr 抑制Foxp3基因表达的机制是CNS2（conserved noncoding sequence，CNS）的增强子区域内CpG 簇处的甲基化水平增加，进而抑制了染色质可及性。IL-2 招募转录因子STAT5b 到Foxp3 基因座，稳定Foxp3的表达。Flicr 和IL-2 在维持Treg 细胞数量动态平衡中发挥相反的作用[19]。lncRNA-EGFR(epidermal growth factor receptor，EGFR)在Treg 细胞表达上调并且与肝细胞癌肿瘤大小和EGFR/Foxp3 的表达呈正相关，与IFN-γ 表达呈负相关。lncRNAEGFR 通过EGFR 依赖性方式刺激Treg 细胞分化、抑制CTL 活性并促进HCC 生长。c-CBL（casitas B lineage lymphoma，c-CBL）是激活下游AP-1/NF-AT1 轴的重要蛋白，通过泛素化的方式降解EGFR。lnc-EGFR 与EGFR 特异性结合，降低了c-CBL 引起EGFR 泛素化的水平，有利于肿瘤的生长[20]。乳腺癌患者外周血Treg 细胞比例增加，CD4+T 细胞高表达lncRNA-SNHG1，Foxp3，IL-10和IDO（indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO），低表达miR-448。CD4+T 细胞敲除lncRNA-SNHG1，可以降低Foxp3，IL-10和IDO表达，增加miR-488表达，抑制Treg 细胞分化。RIP 和RNA pull-down 等实验证明lncRNA-SNHG1 靶向结合miR-448，抑制miR-448 下调IDO 的功能。小鼠敲除lncRNA-SNHG1 的模型显著的减小肿瘤体积，延缓肿瘤发展[21]。

3 lncRNA 与免疫性疾病

lncRNA 参与免疫性疾病的发生发展过程，在免疫病理和免疫调控中发挥重要作用。本文简要汇总lncRNA 在免疫性疾病中的研究进展。

3.1 lncRNA 与过敏 在过敏性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的发生过程中，Th1/Th2 比例下降。AR患者鼻黏液（AR-EXO）和鼻上皮细胞（OVA-EXO）的外泌体中高表达长非编码RNAGAS5（LncGAS5）。lncGAS5 抑制Th1 细胞分化并促进Th2 细胞分化。lncGAS5 通过抑制AR-EXO 细胞的EZH2 和T-bet转录表达，进而抑制了Th1 细胞分化。因此，AR 上皮来源外泌体中的lncGAS5 是Th1/Th2 分化的关键因子，为AR 提供了可能的治疗靶标[22]。Th2-LCR lncRNA 调控IL-4，IL-5，IL-13 的表达，影响Th2细胞分化。当敲除Th2-LCR lncRNA 后，CHIPqPCR 实验显示招募WDR5 到IL-4，IL-5，IL-13 启动区的水平明显下降，引起启动子区H3K4 me3 明显降低，导致IL-4，IL-5，IL-13 合成减少。

哮喘患者外周血lncRNA-MALAT1 高表达和miR-155 低表达，引起Th1/Th2 比值降低。在CD4+T 细胞中过表达pcDNA3.1-MALAT1 后，抑制miR-155 表达，同时IFN-γ，IL-2 和T-bet 表达下降；敲除MALAT1 后促进miR-155 表达，IL-4，IL-10 和GATA3表达增加。lncRNA-MALAT1 的表达与Th1/Th2 比例呈负相关，而miR-155 表达与Th1/Th2 比例呈正相关。MALAT1 充当海绵体吸附miR-155，减弱miR-155 降解靶基因的能力。因此，通过调控lncRNA-MALAT1 和miR-155 的表达来调节Th1/Th2 的比例，可能成为治疗哮喘的靶点[23]。

3.2 lncRNA 与自身免疫性疾病 类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）患者的PBMC 中Th17细胞的NEAT1 表达升高，小鼠体内注射siRNANEAT1 可以降低Th17 细胞表达，缓解II 型胶原诱导的小鼠关节炎模型的关节炎程度[15]。多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）患者PBMC 的微阵列数据显示，Th17 细胞中的DDIT4 和lncRNA DDIT4 上调[24]。

免疫性血小板减少性紫癜（immune thrombocytopenic purpura，ITP）患者的PBMC 和ITP 小鼠脾脏细胞中lncRNA GAS5 表达均下调。在Naive CD4+T 细胞中过表达lncRNAGAS5，抑制Th17 细胞分化，但不影响Treg 细胞分化。lncRNAGAS5促进TRAF6（TNF receptor-associated factor 6，TRAF6）介导的STAT3 泛素化，抑制Th17 细胞分化并减轻ITP[25]。Treg/Th17 细胞比例平衡在维持免疫稳定中发挥重要作用，但是ITP 患者Treg/Th17 细胞比例存在失衡。ITP 患者外周血CD4+T 细胞的lncRNAMEG3 表达明显升高。lncRNA-MEG3 直接结合miR-125a-5p，竞争性的抑制了Foxp3 表达，促进RORγt 表达，促使Treg/Th17 细胞比例失衡，引发ITP[17]。

桥本甲状腺炎（Hashimoto’s Thyroiditis，HT）患者NeST 表达水平与循环Th1 细胞数量，T-bet 和IFN-γ 呈现正相关性，增强Th1 细胞清除病毒和细菌感染的能力[26-27]。

4 小结

lncRNA 在调控CD4+T 淋巴细胞的增殖分化和免疫疾病中具有重要作用。但是其作用和机制研究还不够全面深入，例如lncRNA 在调控Tfh，Th9，Th10，Th22 细胞功能和机制研究鲜有相关文献报道。lncRNA 可能成为免疫相关疾病如自身免疫性疾病的预防、诊断及治疗提供新的对策。