张雨田 王 红 屈子怡 杨朝帅 冯彬彬 王悦豪

1.天津中医药大学研究生院，天津 300000；2.天津中医药大学第二附属医院普通外科，天津 300000

2018 年我国心血管疾病死亡率居首位，占居民疾病死亡构成的40%以上[1]。而高胆固醇血症是引起动脉粥样硬化最重要的危险因素[2]。虽然目前他汀类、PCSK9、依折麦布等已被广泛应用于临床，但仍存在一些不足[3]。因此需要不断探索来发现新的、实用且有效的药物来治疗高胆固醇血症。近年来有学者认为痰湿体质与高胆固醇血症等代谢性慢性病的发生具有密切的关系[4-5]，脾气健运才能将津液吸收、传输到全身各脏腑。脾不健运则津液失于输布，酿湿为痰，痰湿造成气血运行受阻，进而化生血浊，阻滞于脉道。本研究选取治疗健脾祛湿的代表药物参苓白术丸作为实验药物，以高脂饮食建立原发性高胆固醇血症豚鼠模型，旨在观察参苓白术丸对高胆固醇血症豚鼠模型的影响及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

普通级Hartley 豚鼠，雄性，80～90 d，体重250～300 g，由北京隆安实验动物养殖中心提供[动物生产许可证编码：SCXK（京）2014-0003]。实验动物自由饮水、进食。高脂饲料（10.0%猪油，0.5%胆固醇，89.5%基础饲料）及普通饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供[许可证号：SCXK（京）2014-0010]。实验过程遵循天津医药研究院和国家有关实验动物保护与使用的准则，并经天津医药研究院实验动物伦理委员会批准。

1.2 药物

参苓白术丸（天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，批号：B094067，规格：6 g/100 粒）；依折麦布片[MSD Pharma（Singapore）Pte Ltd，批号：ZEZPA16001，规格：10 mg/片]。

1.3 试剂与仪器

血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒[积水医疗科技（中国）有限公司，批号：822RBO、826RCO、824RLN、823RAO]；总胆汁酸测定试剂盒及蛋白定量测试盒[南京建成生物工程研究所，批号：E003-2]；尼曼-匹克C1 型类蛋白1（Niemann-Pick C1 like 1，NPC1L1）、三磷酸腺苷结合盒转运体G5（ATP binding cassette transport G5，ABCG5）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；肝脏X 受体α（liver X receptor α，LXRα）、胆固醇酰基转移酶2（acyl-CoA cholesterol acyltransferase 2，ACAT2）测定试剂盒（上海蓝基生物科技有限公司，批号：E02A0863、E02A0677）。

KHB ST-360 型酶标仪（上海科华生物工程股份有限公司）；日本OLYMPUS 公司BX53 型偏光显微镜、DP73 型显微镜摄像头、SZ2-STS 型体视显微镜。

1.4 实验方法

1.4.1 实验动物分组、造模及给药 豚鼠适应性喂养1 周，将其分为对照组，模型组，依折麦布组，参苓白术丸高、中、低剂量组，每组10 只。对照组给予普通饲料，其余组均给予高脂饲料，在室内温度为20～25℃，相对湿度为40%～70%，明暗周期12 h/12 h 的条件下喂养8 周建立原发性高胆固醇血症豚鼠模型。

造模4 周后开始药物灌胃干预，给药体积为10 ml/kg。依折麦布组予依折麦布混悬液（1 mg/kg），参苓白术丸高、中、低剂量组分别予17.00、8.50、0.85 g/kg，模型组和对照组给予等体积生理盐水，1 次/d，连续4 周。实验期间各组动物均自由饮水摄食。

1.4.2 实验动物取材 末次给药后各组禁食不禁水12 h，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置30 min 后，3000 r/min 离心10 min，-80℃冻存备用；取肝、末端回肠、远端空肠组织置-80℃保存，另取肝组织于10%中性甲醛溶液固定，行组织病理学HE 染色观察；结扎胆囊管并完整取下胆囊，收集胆囊胆汁并观察成石情况同时行胆囊胆汁测定。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 血液生化指标检测 采用全自动生化分析仪检测各组豚鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C 的含量。

1.5.2 胆汁TC、总胆汁酸测定 测定采用酶比色法及酶显色法，按试剂盒说明进行。胆汁-20℃保存。

1.5.3 HE 染色法观察肝脏组织形态学变化 肝脏组织置于10%中性甲醛溶液固定24 h，逐级乙醇脱水、透明，浸蜡，包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肝组织病理形态学变化。

1.5.4 酶联免疫吸附试验法测定小肠组织NPC1L1、ABCG5、ACAT2、LXRα 的表达 取各组动物小肠组织，提取组织裂解液（离心半径10 cm，8000 r/min，离心15 min），配置试剂，继续按照检验步骤进行，在反应终止后5 min 内用酶标仪在450 nm 波长依序测量各孔的光密度（optical density，OD）值，将样本的OD值代入方程式，计算出样本浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD-t 检验；两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比较

与对照组比较，模型组血清TG、TC、LDL-C 水平均升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，参苓白术丸低剂量组TG 水平降低，差异有统计学意义（P ＜0.05）；参苓白术丸中剂量组血清TG、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）；参苓白术丸高剂量组血清TG、TC、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表1。

表1 各组血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比较（mmol/L，）

表1 各组血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比较（mmol/L，）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇

2.2 各组胆汁TC、总胆汁酸水平比较

与对照组比较，模型组胆汁TC、总胆汁酸水平均升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，参苓白术丸中、高剂量组胆汁TC、总胆汁酸水平均降低，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表2。

表2 各组胆汁TC、总胆汁酸水平比较（）

表2 各组胆汁TC、总胆汁酸水平比较（）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。TC：总胆固醇

2.3 各组肝脏病理组织学观察

对照组肝脏组织基本正常；模型组可见弥漫性大泡性脂肪变，肝组织内广泛的肝细胞气球样变、少量炎症细胞浸润和点状细胞坏死；依折麦布组脂肪变性显著减轻；参苓白术丸中、高剂量组脂肪变性及肝细胞气球样变显著减轻；参苓白术丸低剂量组肝细胞脂肪样变性改善较模型组不明显。见图1。

图1 肝脏病理组织学图片（HE 染色，200×）

2.4 各组NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比较

与对照组比较，模型组NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 水平均升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组比较，参苓白术丸中、高剂量组NPC1L1、ACAT2、LXRα 水平均降低，ABCG5 水平均升高，差异均有统计学意义（P ＜0.05）。见表3。

表3 各组NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比较（ng/g，）

表3 各组NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比较（ng/g，）

注：与对照组比较，aP ＜0.05；与模型组比较，bP ＜0.05。NPC1L1：尼曼-匹克C1 样蛋白1；ACAT2：胆固醇酰基转移酶2；ABCG5：三磷酸腺苷结合盒转运体G5；LXRα：肝脏X 受体α

3 讨论

中医无“高胆固醇血症”病名，但一般认为其在“痰浊”“痰湿”等范畴中[6]。中医理论认为该病病机本质乃“本虚标实”，本以“脾虚”为要，标以“湿浊”为主[7]。故治疗应从健脾祛湿入手，作为健脾祛湿经典方剂，参苓白术丸由莲子肉、薏苡仁、陈皮、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、人参、白术、山药、甘草组成。现代药理学研究发现，参苓白术丸的多个有效成分对脂质代谢失调均有明显的改善和调节作用[8-11]。因此，本研究选取不同剂量的参苓白术丸探究其对原发性高胆固醇血症豚鼠的影响，为临床使用参苓白术丸调节胆固醇代谢提供实验依据。

小肠从食物中吸收的胆固醇占人体摄取胆固醇总量的50%[12]。在此过程中NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 起到重要作用[13-19]。有研究[20]显示，阻断NPC1L1的内吞可以抑制胆固醇进入吸收细胞；ACAT 作为细胞内唯一可以催化胆固醇酯合成的酶，当抑制小肠中ACAT2 时，可阻断小肠对饮食来源胆固醇的摄取[21]；ABCG5 除了可促进胆固醇从小肠上皮细胞运至肠腔随粪便排出，还能促进胆固醇逆转运，促进肝脏将胆固醇分泌入胆汁排出体外[22-24]；LXRα 可以抑制小肠NCP1L1、上调ABCG5 的表达，减少肠道对胆固醇的吸收。上调毛细胆管的肝细胞中ABCG5 的表达，增加肝胆固醇向胆汁中的直接排放；促进限速酶CYP7A1，将肝胆固醇转化为胆汁酸；调节SREBP-1c 将胆固醇转换成脂肪酸等方式[25-28]。因此调控这些蛋白的表达，对治疗原发性高胆固醇血症具有重要意义。

本研究结果显示，与对照组比较，模型组血清TG、TC、LDL-C 水平均升高（P ＜0.05），提示原发性高胆固醇血症动物造模成功[29-30]。与模型组比较，参苓白术丸中、高剂量组NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平均下降，ABCG5 水平均升高（P ＜0.05），提示参苓白术丸中、高剂量组可以下调高胆固醇血症豚鼠模型小肠NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平，上调ABCG5 水平。

本研究结果显示，与模型组比较，参苓白术丸中、高剂量组TG、LDL-C 水平及胆汁TC、总胆汁酸含量均降低（P ＜0.05），且肝脏的脂肪变性、肝细胞气球样变也较模型组改善。提示参苓白术丸中、高剂量组可以改善高胆固醇饮食所导致的原发性高胆固醇血症，减轻肝脏细胞脂肪样变。其可能的机制是参苓白术丸通过下调NCP1L1、ACAT2，上调ABCG5 来降低胆固醇水平；若要明确该结论，还需要阻断该信号通路，检测参苓白术丸是否具有降脂作用来进一步确定。

本研究结果显示，与模型组比较，参苓白术丸中、高剂量组LXRα 水平降低（P ＜0.05）。在高胆固醇条件下，LXRα 上调SREBP-1c 的表达，而SREBP-1c 过表达将使大量固醇转换成脂肪酸，超出人体代谢能力后会引起肝脏脂肪变性，最终形成非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[31-33]。参苓白术丸中、高剂量组可以通过下调LXRα 水平改善原发性高胆固醇血症豚鼠模型的NAFLD。

综上所述，参苓白术丸中、高剂量可以降低NPC1L1、ACAT2 及LXRα 表达，上调ABCG5 水平；能够降低高胆固醇血症豚鼠模型的血脂水平，改善胆汁TC 和总胆汁酸浓度，减轻肝脏脂质沉积。今后本课题组将进一步明确参苓白术丸影响原发性高胆固醇血症豚鼠胆固醇水平的机制，为参苓白术丸治疗高脂血症提供更有力的实验数据支持。