曹 芹, 王 丹

(重庆市第九人民医院, 1. 麻醉科, 2. 消化内科, 重庆, 400700)

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，发病早期没有典型的临床特征，很多患者在确诊时已经发生了转移，错过了最佳的治疗时机[1]。罗哌卡因具有镇静和麻醉作用，是首个纯左旋长效酰胺类的麻醉药，罗哌卡因可通过阻断神经细胞中的钠离子通道，抑制钠离子进入神经纤维细胞膜中，进而阻滞神经纤维内的信号传导[2]。研究[3-4]发现，罗哌卡因具有抗肿瘤作用，罗哌卡因能够抑制宫颈癌、肝癌等肿瘤细胞增殖。罗哌卡因处理后的食管癌细胞迁移能力降低[5]。已有实验[6]显示，胃癌细胞经罗哌卡因处理后细胞增殖能力下降，划痕愈合能力降低，但目前对罗哌卡因通过何种机制发挥抗胃癌作用还不明确。

Wnt属于分泌蛋白，可通过作用于细胞膜上的受体影响细胞内信号传导，进而调控下游基因的表达，参与细胞迁移、分化、增殖等过程[7]。目前在人以及鼠体内发现了Wnt的19个成员, β-catenin和Wnt1是Wnt信号通路的关键因子，二者表达水平与Wnt信号通路激活水平有关[8]。研究[9]发现，Wnt在胃癌中过度激活，而抑制Wnt可减弱细胞恶性增殖和转移能力。本研究探讨罗哌卡因调控Wnt信号抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的机制，为明确罗哌卡因抗肿瘤机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

基质金属蛋白酶-9(MMP-9)抗体购自武汉博士德生物工程有限公司; 胃癌细胞NCI-N87购自美国ATCC; 基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抗体购自美国Cell Signaling Technology; Wnt1抗体购自美国Abcam; β-连环蛋白(β-catenin)抗体购自南京建成生物工程研究所; 罗哌卡因购自宜昌人福药业(国药准字H20103636); 上皮钙黏蛋白(E-cadherin)抗体购自北京义翘神州科技股份有限公司; BCA蛋白浓度检测试剂盒购自北京蓝博斯特生物技术有限公司; 钙黏蛋白(N-cadherin)抗体购自美国Proteintech。

1.2 实验分组

用0、160、320、640 μg/mL罗哌卡因细胞培养液培养胃癌细胞，记为对照组、ROP-L组、ROP-M组、ROP-H组; 用含有25 mmol/L的Wnt信号激活剂Licl和640 μg/mL罗哌卡因的细胞培养液培养胃癌细胞，记为ROP-H+Licl组，以ROP-H组为参照。

1.3 MTT检测罗哌卡因对胃癌细胞增殖影响

胃癌细胞培养在含有10%胎牛血清的DMEM中进行，细胞培养参数为: 37 ℃, 5% CO2培养箱。将培养至对数生长期的胃癌细胞按照每个孔内添加4 000个细胞接种到96孔细胞培养板中，每个孔内添加100 μL的细胞培养液，细胞培养过夜后，分别在细胞中添加罗哌卡因，使罗哌卡因终浓度为0、40、80、160、320、640 μg/mL, 细胞培养24 h后，在每个孔内添加10 μL的MTT溶液，继续放在37℃的培养箱内孵育培养2 h。弃掉孔中的液体，继续添加150 μL的二甲基亚砜溶液，孵育10 min后，立即用酶标仪测定每个孔在450 nm的吸光度值(OD)。以OD值表示细胞增殖活性。

1.4 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭

细胞迁移实验: 对照组、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl组细胞分别用无血清细胞培养液制备成单细胞悬浮液。每个检测样品吸取0.2 mL至Transwell小室的上室内，同时吸取0.6 mL的含胎牛血清的细胞培养液至下室内，置于培养箱内孵育24 h。将小室取出，用棉签擦掉基质胶以及没穿膜的细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，添加95%的乙醇固定15 min, 用结晶紫染色。随机选择5个视野，在显微镜下统计迁移数量，平均值为结果。

细胞侵袭实验具体操作如下: 对照组、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl组细胞分别用无血清细胞培养液制备成单细胞悬浮液。把matrigel放在4 ℃融化，吸取50 μg的matrigel添加到95 μL的无血清细胞培养液内，将稀释以后的matrigel添加到Transwell小室内，转移到37℃孵育1 h。分别取0.2 mL的培养液加入到Transwell小室的上室内，同时吸取0.6 mL的含胎牛血清的细胞培养液至下室内，置于培养箱内孵育2 d。将小室取出，利用棉签擦掉基质胶以及没穿膜的细胞，用PBS洗涤2次，添加95%的乙醇稳固15 min, 随后使用结晶紫进行染色。任意选取5个角度，使用显微镜完成侵袭数目计算，结果取平均值。

1.5 Western blot检测细胞中MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin、Wnt1、β-catenin蛋白表达

对照组、ROP-L、ROP-M、ROP-H、ROP-H+Licl组细胞培养24 h以后，分别在细胞中加入含有1% PMSF的RIPA溶液，置于冰上裂解30 min, 转移至离心管内，以4 ℃、12 000 g离心15 min, 小心吸取上清，分装，以BCA方法测定蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳采用10%分离胶、5%浓缩胶。把2×Loading Buffer添加到蛋白溶液中，在100 ℃的前提下孵化5 min。每个上样孔中均分别加入30 μg蛋白样品，电泳使用70 V的电压，观察染料到达分离胶时，调整电压为100 V继续电泳，观察溴酚蓝到达凝胶的下端时，终止电泳。把凝胶取出，裁剪合适大小的NC膜，放在转移缓冲液中浸泡备用。设置200 mA恒流、冰上转膜50 min。把NC膜置于5%牛血清白蛋白内，于室温环境孵育2 h。将1∶1 000一抗溶液稀释后放入NC膜，放在4 ℃孵化一整晚。最后将二抗溶液1∶4 000稀释后浸泡NC膜，放在37 ℃结合2 h。按照ECL方法显色。将GAPDH设置为参照，分析条带的灰度值，以灰度值计算蛋白表达水平。

1.6 统计学分析

2 结 果

2.1 罗哌卡因对胃癌细胞增殖影响

相较于0、40、80 μg/mL罗哌卡因处理后的胃癌细胞增殖活性[(0.67±0.08)、(0.68±0.06)、(0.65±0.05)], 160、320、640 μg/mL罗哌卡因处理后的胃癌细胞增殖活性降低[(0.50±0.04)、(0.42±0.03)、(0.35±0.03)]。选择160、320、640 μg/mL的罗哌卡因进行后续研究。

2.2 罗哌卡因对胃癌细胞迁移和侵袭影响

与对照组比较, ROP-L、ROP-M、ROP-H组胃癌细胞迁移和侵袭数目逐渐减少以及细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达水平均逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。罗哌卡因抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，见图1、表1。

表1 罗哌卡因处理后的胃癌细胞迁移数目、侵袭数目和细胞中MMP-9、MMP-2蛋白水平

2.3 罗哌卡因对胃癌细胞上皮间质转化(EMT)影响

与对照组比较, ROP-L组、ROP-M组、ROP-H组胃癌细胞中E-cadherin蛋白表达水平逐渐升高, N-cadherin蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。罗哌卡因抑制胃癌细胞的EMT, 见图2、表2。

表2 罗哌卡因处理后的胃癌细胞E-cadherin、N-cadherin蛋白水平

2.4 罗哌卡因对胃癌细胞中Wnt信号通路影响

与对照组比较, ROP-L组、ROP-M组、ROP-H组胃癌细胞中Wnt1、β-catenin蛋白表达水平逐渐降低，差异有统计学意义(P<0.05)。罗哌卡因抑制胃癌细胞的Wnt信号通路，见图3、表3。

表3 罗哌卡因处理后的胃癌细胞Wnt1、β-catenin蛋白水平

2.5 Wnt信号激活剂Licl对罗哌卡因抑制胃癌细胞Wnt信号通路的作用

与ROP-H组比较, ROP-H+Licl组胃癌细胞中Wnt1、β-catenin蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见图4、表4。

表4 Wnt信号激活剂Licl和罗哌卡因处理后的胃癌细胞Wnt1、β-catenin蛋白水平

2.6 激活Wnt信号对罗哌卡因影响胃癌细胞迁移、侵袭和EMT作用

与ROP-H比较, ROP-H+Licl组胃癌细胞迁移数目和侵袭数目升高, MMP-9、MMP-2、N-cadherin蛋白水平升高, E-cadherin蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5、表5。

表5 Wnt信号激活剂Licl和罗哌卡因处理后的胃癌细胞增殖活性、侵袭数目、迁移数目和MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白水平

A: 胃癌细胞NCI-N87的迁移侵袭(放大倍数200倍); B: MMP-9、MMP-2、E-cadherin、N-cadherin蛋白表达。

3 讨 论

罗哌卡因是纯S(-)型镜像体结构，为常见的临床麻醉药。近些年来，罗哌卡因在肿瘤中的作用引起广泛重视[10]。有实验[3-5]发现，罗哌卡因对宫颈癌、肝癌、食管癌等多种肿瘤细胞有抑制作用，且罗哌卡因还可在体外抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。罗哌卡因对胃癌也有抑制作用，其处理后的胃癌细胞增殖能力降低，划痕愈合能力下降[6, 11]。本研究发现，罗哌卡因可降低胃癌细胞增殖活性，抑制胃癌细胞迁移和侵袭，这说明罗哌卡因有抗胃癌转移的作用，与既往研究结果相符合。

肿瘤的转移过程十分复杂，肿瘤细胞在转移至新的组织和器官时，能够合成大量的细胞外基质降解酶，破坏细胞外基质结构，为肿瘤的转移提供条件[12-13]。基质金属蛋白酶是常见的细胞外基质降解酶，其蛋白成员很多，分别能够将不同的细胞外基质组分降解，为肿瘤的转移提供条件[14]。基质金属蛋白酶家族成员有MMP-2和MMP-9, 基质金属蛋白酶在肿瘤中的表达有所增加后，会加速肿瘤细胞的迁移[15]。EMT是指细胞上皮特征逐渐消失而间质细胞特征逐渐明显的过程，在胚胎发育、组织生长等过程中均有EMT现象[16]。E-cadherin是上皮细胞标志蛋白，其在EMT过程中表达下调。N-cadherin是间质细胞标志蛋白，其表达水平升高标志着EMT水平增加[17]。肿瘤相关研究[18]显示, EMT是肿瘤转移的早期标志事件，肿瘤细胞EMT后迁移和侵袭能力增加。本研究显示，胃癌细胞经罗哌卡因处理后, MMP-9和MMP-2蛋白表达水平均有所降低, E-cadherin蛋白表达水平减少, N-cadherin蛋白表达水平降低，这说明罗哌卡因阻滞胃癌细胞EMT, 制止胃癌细胞的转移和入侵，这与细胞侵袭的研究结果相符。

虽然已经明确了罗哌卡因具有抗肿瘤作用，但目前尚不清楚罗哌卡因的作用机制。既往实验[3, 5, 11]发现，罗哌卡因抗肿瘤作用与信号通路如JNK、ERK、STAT3等有关。本研究发现，罗哌卡因处理后的胃癌细胞中Wnt1、β-catenin蛋白水平降低。Wnt1、β-catenin是Wnt信号通路的关键因子，二者表达水平升高后标志着Wnt信号通路被激活[19]。Wnt是在人体组织中具有多种生物学作用的信号通路，在能量代谢、氧化应激、炎症、细胞增殖等多个生理过程中发挥作用[20]。研究[21-22]证明肿瘤组织中Wnt信号过度激活，Wnt信号可激活细胞增殖、迁移，促进肿瘤进展。Wnt激活增加胃癌细胞增殖、侵袭、迁移和EMT水平，而抑制Wnt信号可降低胃癌细胞生长和转移能力[23]。本研究显示，罗哌卡因降低胃癌细胞中Wnt激活水平，并且Wnt信号激活剂可逆转罗哌卡因对胃癌细胞增殖、迁移、侵袭以及EMT的作用，提示罗哌卡因通过Wnt发挥作用。

综上所述，罗哌卡因通过下调Wnt激活水平抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT, 可为后续研究罗哌卡因抗胃癌作用机制提供参考。此外，罗哌卡因通过何种靶向机制影响Wnt进而调控胃癌还有待进一步研究。