聂 倩， 张青青， 白忠臣， 张正平

(1.贵州大学 大数据与信息工程学院，贵州 贵阳 550025； 2.贵州大学 贵州省光电子技术及应用重点实验室，贵州 贵阳 550025； 3.贵州大学 医学院，贵州 贵阳 550025)

0 引 言

Tau蛋白与微管蛋白(microtuble associated protein,MAP)，相互作用，参与神经细胞骨架的构建，在神经系统中起着重要作用[1]。近年来，在神经退行性疾病的研究中，Tau蛋白作为阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)的生物标志物之一，在辅助疾病的临床诊断和干预治疗中具有重要意义[2]。

近年来，出现了许多生物传感器的技术如电化学方法和光学方法用于检测微量的Tau蛋白[3～10]。光学生物传感器是最常见的生物传感器[8]，目前，表面增强拉曼散射(surface enhanced Raman scattering,SERS)、荧光法和光波干涉法已经被广泛应用于其中[9,10]。由于光学生物传感器中的SERS传感器相比电化学传感器和压电传感器具有更高的检测灵敏度和更低的检测限，并且能够直接、实时和无标记检测。因此，这里选择SERS传感器来研究和构建Tau蛋白生物传感器。

SERS是利用金属纳米结构表面产生的表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)[11]引起的高强度局域电磁场来增强待测分子拉曼信号的一种高灵敏度技术。SERS作为一种振动光谱技术，可以提供有关分子结构的具体信息。利用SERS技术，能检测到浓度极低的有机物的分子振动信号，实现生物和化学分子的无损和超高的灵敏度的检测[12]。通常采用表面粗糙的贵金属纳米结构如金、银和铜等来产生电磁热点以获得SERS信号，电磁场的强度可以通过调节纳米结构形态来调节。因此制备精细的金属纳米结构基底对于SERS信号的强度和灵敏度十分重要。

1 实验与方法

1.1 实验材料

聚合度为1 700，醇解度为98 %的聚醋酸乙烯醇(polyvinyl acetate,PVA)粉末(上海阿拉丁试剂有限公司)用作还原剂；三聚氰胺粉末(分析纯，上海阿拉丁试剂有限公司)用作薄膜的增强因子(enhancement factors,EFs)测试；硝酸银(AgNO3)粉末(分析纯，国药集团有限公司)用于沉积银岛薄膜；甲醇(天津富宇精细化工有限公司)用于溶解三聚氰胺；Tau441蛋白质(ab84700，上海艾博抗有限公司)用作待检测蛋白质分子；浓度为0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)(上海索莱宝有限公司)，用于Tau441蛋白质的稀释剂；表面镀有氧化铟锡薄膜的ITO玻璃(华南湘城科技有限公司)的规格为20 mm×20 mm×0.55 mm，用作银岛薄膜的支撑基底；在整个实验中使用的水均为去离子水。所有试剂在使用时均没有经过进一步纯化。

1.2 薄膜基底的制备

1)PVA/AgNO3混合液的制备:a.PVA水溶液的制备:称取5 g PVA粉末溶解到45 mL去离子水中，并在90 ℃下以500 r/min的转速搅拌1 h，获得质量分数为10 %的PVA水溶液;b.AgNO3水溶液的制备：分别称取AgNO3粉末(0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5)g溶解在1 mL去离子水中，得到质量分数为0 %，9 %，17 %，23 %，28 %，33 %的AgNO3水溶液;c.PVA/AgNO3混合液的制备:将AgNO3水溶液分别与5 mL，质量分数为10 %PVA水溶液均匀混合，放置在黑暗环境中1 h，备用。

2)旋涂法制备PVA/AgNO3复合薄膜:分别量取0.2 mL含有不同质量分数AgNO3的PVA/AgNO3水溶液均匀滴在ITO玻璃基底上，采用旋涂法制备PVA/AgNO3复合薄膜。匀胶机采用三阶转速以获得均匀的薄膜：第一转速500 r/min，10 s；第二转速1 000 r/min，10 s；第三转速4 000 r/min，40 s。

3)复合薄膜的热处理:使用自制热处理系统对复合薄膜进行热处理，自制热处理系统如图1(a)所示，主要由支撑架、酒精灯、加热台(80 mm×80 mm×3 mm)、温度传感器和玻璃罩组成。自制热处理系统的温度特性如图1(b)所示，随着加热时间的增加，加热台表面的温度逐渐升高，在350 s时达到500 ℃并稳定在其附件，温度的均匀性为(500±3)℃。热处理前，加热10 min使加热台受热均匀。随后，PVA/AgNO3复合薄膜放置于加热台上，在500 ℃左右下加热10 min，然后取下薄膜并冷却至室温，获得银岛薄膜基底。

图1 自制热处理器及其温度特性

1.3 薄膜基底的表征

使用材料显微系统(DM—2700,Leica,Germany)观察薄膜表面形貌，该显微系统配备电荷耦合器件(CCD,Du934P,Andor)。使用接触式台阶仪(ET 150,Kosaka Lab,Japan)测量薄膜基底的厚度。使用场发射扫描电子显微镜和能量色散X射线光谱仪(SEM-EDS, SU8100,Hitachi,Japan)表征银岛薄膜的形态和薄膜表面元素组成及元素分布。使用X射线衍射仪(D8 Advance,Bruker,Germany)表征薄膜基底的化学组成。使用显微拉曼光谱仪系统(SR—500I—B1,Andor,England)测量拉曼光谱，激发光源为532 nm连续激光器(Torus, Laser Quantum,England)。

1.4 溶液的配置和Tau蛋白生物传感器构建

三聚氰胺溶液的配制：将50 mg三聚氰胺粉末溶解在500 mL甲醇溶液中，并在300 r/min和60 ℃下搅拌10 min制备得到浓度为100 mg/L的三聚氰胺甲醇溶液。

Tau蛋白检测液的配制。用移液枪将浓度为0.2 g/L，规格为250 μL的Tau蛋白原溶液分装在25管微量离心管中，每管10 μL。取5管用作配制溶液，使用PBS作为稀释剂分别配制浓度为500,100,85,70,50,30,15,10,1 mg/L的Tau蛋白溶液保存于冰箱4～6 ℃环境下备用。

Tau蛋白生物传感器的构建示意图如图2所示。系统由激光器、浸泡过Tau蛋白溶液的薄膜基底、光纤、滤光片、CCD、耦合器、动镜、透镜、衰减器、拉曼光谱仪和电脑组成。

根据2017年陕西省统计年鉴，陕西省有11个地级市，按区域分为3个地区：陕南（汉中市、安康市、商洛市）、陕北（延安市、榆林市）、关中（西安市、铜川市、宝鸡市、咸阳市、渭南市、杨凌示范区）。本文主要从这3个区域的发展状况为出发点对陕西省区域协调发展进行研究。

图2 Tau蛋白生物传感器的构建简图

2 结果与讨论

2.1 薄膜基底的形貌

AgNO3的含量直接决定了薄膜上纳米结构的形态。当AgNO3质量分数为9 %时，还原出的银纳米颗粒平均大小为162.6 nm，如图3(a)所示;当AgNO3质量分数为17 %时，迷宫结构银纳米线的平均宽度为277.6 nm，如图3(b)所示;当AgNO3质量分数增加到23 %时，迷宫结构银纳米线相互连接，平均宽度为282.9 nm,如图3(c)所示;在质量分数为28 % AgNO3薄膜表面，均匀的纳米骨架结构呈银岛形状，平均宽度为291.5 nm，如图3(d)所示；当AgNO3质量分数达到33 %时，薄膜表面上的纳米结构非常不均匀，产生了大量的凹陷和凸起，平均宽度为348.4 nm，如图3(e)所示。

图3 不同质量分数的AgNO薄膜基底表面SEM图和银岛尺寸统计

PVA热还原银离子的化学反应式如(1)所示[13]

-(CH2-CH-OH)n-+Ag+→-(CH2-CH-OAg)n-+H+→-(CH2-C=O)n-+Ag0+H+

(1)

在室温下，AgNO3溶液与PVA溶液混合后，PVA链中的羟基与AgNO3配位，形成螯合物，PVA分子链中的强氢键断裂，并且PVA中游离羟基上的孤对电子可以进入Ag+的d或f轨道，形成配位结构。热处理过程中，PVA/AgNO3的螯合物逐渐分解， PVA中大量羟基被氧化为羰基，从而还原了银离子，PVA逐渐消耗和降解，银纳米颗粒进一步聚合、相连、融合形成银岛薄膜。

2.2 薄膜基底的增强特性

前期研究表明[14]，用制备的薄膜基底检测三聚氰胺时，当AgNO3质量分数为9 %，17 %，23 %时，拉曼光谱峰逐渐增强，增强因子也在逐渐变大。AgNO3质量分数为28 %时，拉曼信号在特征峰处强度增强超过20 000个单位，增强因子达到1 149。但是当质量分数超过28 %时，拉曼光谱峰值强度有所下降，在质量分数为33 %时增强因子下降为976。

薄膜基底表面的银岛纳米结构形成等离子体，在532 nm激光激发下银的导带电子集体振荡引起局部表面等离子体激元共振(localized surface plasmon resonances,LSPR)。LSPR与入射光的耦合导致在等离子体纳米结构周围的二次电场产生等离子体热点，有效地将电磁场集中在金属表面/附近(距离<10 nm)并得到极大增强。这种电磁场的极大增强产生了SERS增强效应[15]。随着AgNO3含量增大，其薄膜表面产生的银纳米颗粒增多，并聚集连接融合成银岛结构，银岛间隙变小，形成的等离子体热点增多，极大地增强了三聚氰胺分子的拉曼信号。

由图3(e)可知，AgNO3质量分数为33 %的薄膜基底表面由于过量的银纳米颗粒聚集融合挤压，形成许多凹陷和凸起，骨架中孔的大小和分布很不均匀，形成的等离子体热点减少，SERS信号减弱；凹陷和凸起对仪器的聚焦也产生了很大影响，使得正向散射增强从而降低了SERS信号。

综上分析可知，AgNO3质量分数为28 %的薄膜基底表面均匀性好，SERS增强因子较高，故选用此薄膜基底来构建Tau蛋白生物传感器。如图4所示。

图4 质量分数为28 %的AgNO3薄膜基底拉曼光谱图

2.3 薄膜基底检测Tau蛋白的灵敏度和检测限

图5(a)为薄膜基底上Tau蛋白和PBS缓冲剂的拉曼光谱图，从图5(a)中可以明显看到，PBS缓冲液没有明显的拉曼峰，Tau蛋白溶液在640 cm-1处有最强拉曼峰，因此,选择此处的拉曼光谱峰作为Tau蛋白的特征峰进行分析。

将薄膜基底分别放入20 mL浓度为100，70，50，30，10，1 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，使得Tau蛋白质分子充分吸附在银岛薄膜表面形成蛋白质薄膜，它们的拉曼光谱如图5(b)所示。当Tau蛋白检测浓度逐渐降低时，薄膜基底的拉曼峰值强度逐渐降低。当检测浓度为100 mg/L时，特征峰处的SERS信号强度为2 086；低浓度Tau蛋白的特征峰处的拉曼光谱如图5(c)所示，当检测浓度为10 mg/L时，特征峰处SERS信号强度为475。当Tau蛋白浓度低至1 mg/L时，特征峰处SERS强度为150左右，依然具有很好的识别性，能很好地与背景峰进行区分。

图5 检测Tau蛋白的拉曼光谱图

根据不同浓度Tau蛋白特征峰处的SERS拉曼强度进行“量—效”关系曲线拟合由图6(a)所示，在10～100 mg/L浓度范围之间，薄膜基底检测Tau蛋白的拉曼特征峰具有良好的线性关系，拟合方程为y=17.99x+291.3(x=10～100 mg/L)，相关系数为R2=0.997。根据拟合方程可知，方程的斜率为17.99(a.u./(mg/L)。

为验证Tau蛋白生物传感器的“量—效”关系稳定性和可靠性，将两片薄膜基底分别放入浓度为15,85 mg/L的Tau蛋白溶液中浸泡8 h后，测试其拉曼光谱，验证结果如图6(b)所示。由图可知，这两个浓度的SERS信号强度均匀地落在了拟合曲线的边缘附近。

图6 Tau蛋白生物传感器的“量—效”关系拟合曲线和验证图

3 结 论

本文通过热诱导还原银离子制备银岛薄膜基底，并以此构建Tau蛋白生物传感器。该薄膜基底具有均匀的银岛纳米结构，其骨架的平均宽度为281.5 nm。以三聚氰胺为分子探针，该基底展现出良好的增强特性，其EFs可以达到1 149。以该基底和显微拉曼测量系统构建Tau蛋白生物传感器，检测Tau蛋白的最低检测限可以达到1 mg/L；在10～100 mg/L范围内，传感器具有较好的线性关系；最后对拟合方程进行稳定性验证，传感器表现出较好的稳定性和可靠性。传感器中的薄膜基底制备方法简单、快速、成本低廉，并且具有良好的增强特性，可以为制备低成本的薄膜基底提供一种新的思路；制备的传感器能对低浓度Tau蛋白进行定量检测，在通过检测Tau蛋白水平来早期筛查和诊断AD疾病方面具有很大的潜力。