李书迪，于景华，齐和日玛，马 岚，成日青

（1.内蒙古医科大学药学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古医科大学第一附属医院，内蒙古 呼和浩特 010050）

七味广枣散又名七味芍（绍）沙散，是蒙医用经验方，于1977年被收入《中华人民共和国药典》[1]。本方由广枣、丁香、肉豆蔻等7味药材组成，具有养心、益气、安神之功效，常用于治疗心赫依、心激荡、心悸、气短、失眠、心刺痛、癫狂等西医诊断的冠心病、心绞痛、心肌梗死、心力衰竭等病，均可服用此药[2-3]。目前关于七味广枣散的研究主要集中在临床应用研究[4-7]，对于其质量控制方面的报道较少，而2015年版《中华人民共和国药典》中仅规定了显微及薄层色谱鉴别方法，并不能很好地控制其产品质量[8]。本课题组前期对七味广枣散进行了指纹图谱研究[9]，通过对10批次样品进行相似度评价比较，共标定出27个共有峰，并指认了其中的6个成分。在此基础上，本研究通过进一步优化色谱条件，建立了同时测定其中4种成分含量的HPLC法，以期为七味广枣散（丸）的质量评价和控制提供研究依据。

1 仪器与试药

1.1 实验仪器LC-2030C3D高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KH-250DB型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）；BSA124S电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；800Y型多功能粉碎机（永康市铂欧五金制品有限公司）；H1850型离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1.2 实验试药七味广枣散由内蒙古医科大学药剂实验室制备，批号：20190708，20190807，20190912；没食子酸对照品（批号：181208，纯度98%）购自北京中科质检生物技术有限公司；原儿茶酸对照品（批号：181007，纯度98%）购自北京中科仪友化工技术研究院；5-羟甲基糠醛对照品（批号：111626-201912，纯度99.2%）、丁香酚对照品（批号：110725-201716，纯度99.6%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。

广枣（产地：湖南，批号：1807010519；产地：广东，批号：C17082902）、丁香（产地：广西，批号：193090101，151101）、木香（产地：云南，批号：1811001）、沉香（产地：海南，批号：181411001）、肉豆蔻（产地：广西，批号：190920201）、牦牛心（产地：西藏，批号：170701）、枫香脂（产地：福建，批号：1811010589）均购自内蒙古天康蒙中医药有限责任公司，并经内蒙古医科大学渠弼教授鉴定。

2 方法与结果

2.1 七味广枣散供试品的制备取处方中各单味药材适量，分别用中药粉碎机进行粉碎，过100目筛，得各单味药材细粉。称取广枣细粉45 g，丁香、肉豆蔻、沉香、木香、枫香脂、牦牛心细粉各7.5 g，混匀，即得七味广枣散供试样品。

2.2 色谱条件色谱柱：SHIMADZU Shim-pack GIST（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%乙酸水（B）；梯度洗脱（0~5 min，5%~6%A；5~10 min，6%~11%A；10~20 min，11%~44%A；20~31 min，44%~55%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。

2.3 溶液的制备

2.3.1 混合对照品溶液的制备 精密称取没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚适量，用70%甲醇溶解，制成没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚质量浓度分别为121 μg/mL、144 μg/mL、56 μg/mL、5.10 mg/mL的混合对照品储备液。

2.3.2 供试品溶液的制备 取七味广枣散约1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定质量，超声处理（温度50℃，频率100 Hz）1 h，放冷，再次称质量，用70%甲醇补足减失的质量，10 000 r/min离心5 min，取上清液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.3.3 阴性对照溶液的制备 按“2.1”项下七味广枣散的配方比例及制备工艺，以及“2.3.2”项下供试品溶液的制备方法，分别制成缺广枣、缺丁香的阴性对照溶液及缺广枣、丁香的双阴性对照溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各10 μL，按“2.2”项下色谱条件进样测定，色谱图见图1。结果显示各待测成分吸收峰的峰形良好，4种成分峰与相邻色谱峰之间的分离度均大于1.5。七味广枣散供试品溶液在与没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚对照品相应位置上，均有相同保留时间的色谱峰，而缺广枣的阴性对照溶液无5-羟甲基糠醛及原儿茶酸色谱峰，缺丁香的阴性对照溶液无丁香酚色谱峰，缺广枣、丁香的阴性对照品溶液无没食子酸色谱峰。

图1 HPLC色谱图

2.4.2 线性关系考察 取“2.3.1”项下混合对照品储备液，稀释并配制成不同浓度的系列混合对照品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，以对照品浓度为横坐标（X），以其相对应的峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 线性关系考察结果

2.4.3 精密度试验 取七味广枣散样品（批号：20190912），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得到没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚峰面积的RSD分别为0.39%、0.59%、0.44%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.4.4 稳定性试验 取七味广枣散样品（批号：20190912），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0、1、2、4、8、12、24 h按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算得到没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚峰面积的RSD分别为1.64%、2.31%、0.70%、0.22%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.5 重复性试验 取同一批七味广枣散样品（批号：20190912）6份，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，再按各成分回归方程计算4种成分含量及其RSD值，结果没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚含量的RSD分别为2.46%、2.00%、1.97%、2.40%，表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 取“2.4.5”项下已测知含量的七味广枣散6份，每份约0.5 g，精密称定，置于锥形瓶中，按对照品加入量与供试品中待测成分量之比约为1:1的比例加入对照品，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.5 含量测定取3个批次的七味广枣散样品，每批次精密称取3份，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算4种成分的含量，结果见表3。

表3 样品含量测定结果（±s，mg/g，n=3）

表3 样品含量测定结果（±s，mg/g，n=3）

批号 没食子酸 5-羟甲基糠醛 原儿茶酸 丁香酚20190708 0.533±0.003 0.567±0.001 0.194±0.001 6.495±0.007 20190807 0.521±0.002 0.423±0.002 0.193±0.001 11.165±0.016 20190912 0.574±0.002 0.607±0.010 0.213±0.001 9.456±0.001

3 讨 论

本试验前期首先考察了甲醇及乙腈洗脱系统对色谱峰分离的影响，结果显示乙腈和0.5%乙酸水溶液作流动相时，出峰快，分离效果好；其次本试验利用二极管阵列检测器对样品进行分析，观察全谱的分离与吸收情况，结果显示，在254 nm吸收波长处，各色谱峰信号响应值大，基线平稳，适合样品的总体分析。

在制备供试品溶液时，本试验考察了超声和回流两种提取方式，发现其提取效率无明显差别；又比较了不同浓度甲醇溶液（50%、70%、100%）的提取效果，结果显示，70%甲醇提取的供试品溶液色谱峰响应值更大。综合考虑，选用70%甲醇超声提取1 h作为供试品溶液的制备方法。

蒙药复方制剂的功效是其所含成分整体作用的体现，是多种成分、多种机制综合作用的结果，因此单个成分含量并不能反映其整体疗效[10]。随着分析技术的发展，同时测定多个有效成分的含量已成为控制复方制剂质量的发展趋势。据药理学研究表明，没食子酸具有抗炎、抗氧化生物活性，对心血管疾病具有防治作用[11-12]；原儿茶酸具有抗炎、抗氧化和抑制肿瘤的作用，对缺血、缺氧的神经元细胞有一定保护作用[13]；丁香酚具有抗菌消炎、抗氧化、血管舒张及保护缺氧/复氧损伤心肌细胞等作用[14]。由药理作用可推知，上述3种成分应属于七味广枣散发挥临床疗效的物质基础，而5-羟甲基糠醛是小分子醛类化合物，既具有抗氧化、抗心肌缺血等生物活性，又具有细胞毒性、DNA损伤等毒副作用[15]，因此对这4种成分进行定量研究对提高七味广枣散（丸）的质量标准具有重要意义。

本研究建立的HPLC法同时测定了没食子酸、5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、丁香酚含量，简便、可靠、重现性好，可为七味广枣散（丸）的质量控制及进一步研究提供参考。